高效液相色谱仪和紫外分光光度计

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1、药学院药物化学实验室手册分析实验室要求一 使用仪器设备时，要认真阅读技术说明书，熟悉技术指标、工作性能、使用方法、注意事项，严格遵照仪 器使用说明书的规定步骤进行操作。二 初次使用仪器设备人员，必须在熟练人员指导下进行操作，熟练掌握后方可进行独立操作。三 实验时使用的仪器设备及器材，要布局合理，摆放整齐，便于操作，观察及记录等。四 电子仪器设备通电前，确保供电电压符合仪器设备规定输入电压值，配有三线电源插头的仪器设备，必须 插入带有保护接地供电插座中，保证安全。五 使用仪器设备时，其输入信号或外接负载应限制在规定范围之内，禁止超载运行。六 光学化学仪器及其配件，使用时要轻拿轻放，防止震动。切勿

2、用手触摸光学玻璃表面。发现灰尘及脏物时， 不得用手或抹布擦试，必须使用专用品或专用工具清除。七 有些仪器设备不宜在磁场或电场中操作使用，必须采取屏蔽措施，防止仪器设备损坏或降低测量精度。八 机械类仪器设备，使用前必须进行空载运转确保无故障后方可加载使用。用前润滑，用后擦试干净，注意 日常维护、保养。九 仪器设备不准随意拆改或解体使用，确因需要开发新功能或改造更新等，需按分级管理权限，履行审批手 续后再实施。十 经常进行仪器设备的保养与维护，并存放在干燥通风之处，待用时间过长仪器设备，应定期通电开机，防 止潮霉损坏仪器设备其零部件。十一 大型精度、贵重仪器设备技术指标定期校验和标定制度，保持应有

3、的技术指标。做好使用原始记录。高效液相色谱仪的使用高效液相色谱：是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶 剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进 行检测，从而实现对试样的分析。客队样品做定性定量分析。高效液相色谱原理：色谱法是一种分离技术，试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相 的流体（气体或液体），称为流动相。当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由 于混合物中各组

4、分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动 混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中 流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。高效液相色谱使用方法：一 ：高效液相色谱使用流程（一）、开机：1、打开计算机，进入Windows xp,并运行Bootp Server程序。2、打开 液相色谱各模块电源。3、待各模块自检完成后，双击Ins trumen t1 Online图标，化学工作站自动与液相色谱普通讯，进入的工作站。4、从“View”菜单中选择“Method and Run co

5、ntrol”画面，单击View”菜单中的“ShowTop Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram, Sampling diagram，使其命令前有“ J ”标志，来调用所需的界面（如果已经在 工具栏上就不用此操作了）。5、把流动相放入溶剂瓶中。6、打开Purge阀。7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Se tup pump选项，进入泵编辑画面。8、设Flow： 5ml/min，单击OK。9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump control选项，选中On,单 击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）

6、无气泡为止切换通道继续Purge，直到所有要用通 道无气泡为止。10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump Control选项，选中Off,单击Ok关泵，关闭Purge valve。11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Set up pump选项，进入Pump编辑画面，设Flow： 1.0ml/min。12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。（二）数据采集方法编辑：1 、开始编辑完整方法：从“Me thod菜单中选择“Ed it ent ire met hod 项，如上图所示选中除“Da taanalysis 外的三项，单击Ok,

7、进入下一画面。2、方法信息：在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。单击Ok进入下一画面。3、泵参数设定：（以二元泵为例）在 “Flow处输入流量，如 1ml/min，在 “Solvent B” 处输入 70.0,（A=100-B），也可 Insert 行Time table，编辑 梯度。在“Pressure Limi ts Max处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。单击Ok进入下一画面。4、自动进样器参数设定: 选择合适的进样方式， 进样体积 1.0ul， 洗瓶位置为6号。 “Standard Injection只能输入进样体积，此方式无洗针功能。 “Inj

8、ection with Needle Wash可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Use injector program可以点击Edit键进行进样程序编辑。点击Ok进入下一画面。5、柱温箱参数设定：在Temperature下面的方框内输入所需温度，并选中它，点击more键，如图所示，选中Same as left使柱温箱的温度左右一致。点击ok进入下一画面。6 FLD检测器参数设定：色谱条件：样品：P/N 01018-68704用甲醇稀释为1:10。进样体积：5ul。柱温箱：30C。EX=246nm,EM=317nm ,PMT=10。响应时间=4s.停止时

9、间： 出峰完毕。Excitation A:激发波长:200-700nm，步长为1nm,或Zero Order。Emission:发射波长：280-900nm,步长为1nm,或Zero Order0 PMT:大多数应用适当的设定值 为10,若高浓度样品峰被切平头,则减少PMT值。Peak width：大多数应用设为4s，只有快速分析采用小的设 定值。Multi Ex :多波长及光谱（激发）。Multi Em：多波长及光谱（发射）。同时可以输入范围Range、 步长step、采集光谱。7、在“ Run time checklist 中选中“Data acquisition,单击Ok。8、单击“Me

10、t hod 菜单，选中“Save me thod as，输入一方法名，如“t est ，单击Ok。9、从菜单“View中选中Online signal，选中Windows 1,然后单击Change钮，将所要绘图的信号移到右边的 框中，点击Ok.（如同时检测二个信号，则重复12,选中Windows 2）。10、从“Run control 菜单中选择“Sample info选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Data file 中选择“Manual或“Prefix。区别：Manual-每次做样之前必须给出新名字，否则仪器会将上次的数据覆盖掉。 Prefix一在Prefix框中输入前缀，在Coun

11、ter框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001, vwd0002。11、从Instrument 菜单选择System on。12、等仪器Ready,基线平稳，从Met hod菜单中选择“ Run met hod，进样。（DAD, VWD色谱图如下所示：（三）、数据分析方法编辑:1、从“View菜单中，单击“Da ta analysis进入数据分析画面。2、从“File菜单选择“Load signal,选中您的数据文件名，如下图所示。单击Ok。3、做谱图优化，从“Graphics菜单中选择“Signal options选项，。从Ranges中选择Auto scale及合适的显示

12、时间，单击ok,或选择Use Ranges调整。反复进行，直到图的比例合适为止。4、积分:（1）、从“Integration中选择“Auto integrate,如积分结果不理想，再从菜单中选择“Integration Events选 项，选择合适的Slope sensitivity. Peak width. Area reject. Height reject(2) 、从“Integration”菜单中选择Tntegrate”选项，则数据被积分。(3) 、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。(4) 、单击左边“丁”图标，将积分参数存入方法。5、打印报告:(1) 、从“Rep

13、ort”菜单中选择“Specify report”选项，进入如上画面。(2) 、单击“Quantitative Results”框中Calculate右侧的黑三角，选中Percent (面积百分比)，其它选项不变。(3) 、单击Ok.(4) 、从“Report”菜单中选择“Print report”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击Report 底部的“Prin t”钮。(四) 、关机：关机前，用100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟(如ACN)，然后关泵， (适于反相色谱柱)。 正相色谱柱用适当的溶剂冲洗退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机(用sh

14、u t dow n关)2 流动相的选择：高效液相色谱的流动相通常是各种低沸点溶剂和水溶液。它是影响分离的一个非常重要因素。 在实际工作中，流动相的选择和优化是确定色谱分析的主要工作。1：所选用的流动相溶剂要有一定的化学稳定性，不与固定相和样品组分起反应，其纯度和化学特性必须满足色 谱过程的稳定性和重复性的要求。2：溶剂应当不干扰检测器的工作，溶剂应与检测器匹配，选择不影响检测器正常工作应选择在测定波长范围内 无吸收的流动相。3：在制备分离中, 溶剂应当易于除去, 不干扰对分离组分的回收。4：溶剂的粘度要小，保证合适的柱压降。 5：从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯度要高。

15、 高香液相色谱注意事项：1：开机操作：(1) 、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开Bootp Server(一般启动时已打开)；(2) 、自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时(有六行字符)，打开工作站(先打开On line)；(3) 、打开冲洗泵头的 10异丙醇溶液的开关(需用针捅抽)，控制流量大小，以能流出的最小流量为准；(4) 注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；(5) 、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。2、先以所用流动相冲洗系统一定时间(如所用流

16、动相为含盐流动相，必须先用水冲洗 20 分钟以上再换上含盐 流动相)，正式进样分析前30min左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；3、建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Met hod，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；4、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶 剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；5、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤， 可用 5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；6、实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路 30 分钟以上，

17、再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭 D灯、W灯；7、关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液 的开关；8、使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。 色谱柱：1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围一般为(3PH8)、流动相类型等；2、使用符合要求的流动相；3、使用保护柱；4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如 5甲醇水溶液），再用甲醇冲 洗。5、色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；6、不要高压冲洗柱子；7、不要在高温下长时间使用硅胶键

18、合相色谱柱；流动相：1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油 系膜的使用范围；2、水相流动相需经常更换，严格禁止使用隔夜而未作处理的纯净水，防止长菌变质；3、使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置 含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色 瓶，用于存放水相流动相。样品：1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备

19、样品 溶液，尽量用流动相制备样品液；3、手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的35倍；紫外可见分光光度计（Ultraviolet-Visible Spectrophometed的使用一、工作原理物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原 生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果 子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相 线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸 性和定量分析的基础。分光光度分析就是根据子吸收了入射光中的某些特定 。由于各种物质具有各自不同 同，因此，每种物质就有其 光度的高低判别或测定该物质 物质的吸 收光谱研究物质的波长的光能量，相应地发 的分子、原子

20、和不同的分 特有的、固定的吸收光谱曲 的含量，这就是分光光度定 成分、结构和物质间相互作用的有效手段。紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律。朗伯定律是说明光的吸收与吸收 层厚度成正比 ，比耳定律说明光的吸收与溶液 浓度成正比； 如果同时考虑吸 收层厚度和溶液浓度对光吸 收率的影响， 即得朗伯 -比耳定律。（ A=-LgT=ECL ）二、主要应用2.1检定物质根据吸收光谱图上的一些特征吸收，特别是最大吸收波长虽ax和摩尔吸收系数是检定物质的常用物理 参数。这在药物分析上就有着很广泛的应用。在国内外的药典中，已将众多 的药物紫外吸收光谱的最大 吸收波长和吸收

21、系数载入其中，为药物分析提 供了很好的手段。2.2与标准物及标准图谱对照将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中，在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱。若两 者是同一物质，则两 者的光谱图应完全一致。如果没有标 样，也可以和现成的标 准谱图对照进行比较。 这种方法要求 仪器准确，精密度高，且测定条 件要相同。2.3比较最大吸收波长吸收系数的一致性2.4纯度检验2.5推测化合物的分子结构2.6氢键强度的测定实验证明，不同的极性溶剂产生氢键的强度也 不同，这可以利用紫外光谱来 判断化合物在不 同溶剂中 氢键强度，以确定选择哪一种溶剂。2.7络合物组成及稳定常数的测定2.8反应动力学研究2.9

22、在有机分析中的应用有机分析是一门研究有机化合物的分离、鉴别及组成结构测定的科学，它是在有机化学和分析化学的基 础上发展起来 的综合性学科。三、紫外-可见光分光光度计结构功能简介紫外-可见光分光光度法是以Lambert-beer定律（A=Ec 1）为基础发展起来的。紫外-可见光分光光度计有多种 型号，但仪器的基本结构相似，其基本结构由五个部分组成：光 源 单色器 吸收器 检测器 信号显示系统。紫外可见光分光光度计波长范围（200 llOOnm ）其特点可作微量检测，最小样品量要 求为10卩1或50卩1。灵敏度高、选择性强、易操作。主要功能：光谱扫描功能，用于定性分析；时间驱动 功能，用于研究物质

23、吸光度随时间变化的功能。 波长编程功能，可同时测量 2-8 个波长点的吸光度； 浓度测 定功能，用于定量分析。操作方法：1）开机，自检：打开计算机主机电源，打开显示器，打开 Lambda25 型紫外分光 光度计主机电源开关。等 待计算机自检结束。2）双击 Lambda25 应用软件图标，启动应用软件。3） 在功能选择对话框，选择测量方式如【Scan光谱扫描】【Time时间驱动】【Wp波长编程】【Con浓 度测定】等相应的项目，进行测量。4）在相应测试项目弹出的测量参数设置对话框，设定测试条件。5）用空白液调零，根据不同的测试模式，选择相应的测定指令，按仪器提示进行 测量。6）数据的保存。7）关

24、机。先退出 Lambda25 应用程序，关仪器主机，关计算机主机。8）清洗比色杯。四、紫外分光光度计注意事项及日常维护1、使用范围凡具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物，根据在特定吸收波长处所测得的吸收 度，可用于药品的鉴别、纯 度检查及含量测定。2、注意事项空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预先过滤，并弃去 初滤液。测定时，除另 有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用 1cm 的石英吸收池。 在规定的吸收峰波长 2nm 以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波 长位置是否正确，除另有规定外，吸收峰波长应在 该品种项下规定的波长土2nm以内；否则应考虑

25、该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度，并以吸收度最大 的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.30.7之间的误差较小。吸收池应选择 配对，否则要引入测定误差。在规定波长下两个吸收池的透光率相 差小于 0.5%的吸收池作配对， 在必要的 情况时，须在最终测量扣除吸收池间的误差修正值。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供 试品的吸收度后应减去空白读数，再计算含量。在使用过程中，如需开启试样室盖时或暂时停止测试时， 必须及时推入光门钮杆 （使光电管前光门关闭），保护光电管，以防止光电管受强光或长时间照射而损坏。在测定时或改测其它检品时，应用待测溶液冲洗吸收池34次，用干净

26、绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面 至不留斑痕（切忌把透光面磨损）。取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。 使用完后 及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收 池盒中，防 尘保存。3、日常维护与保养温度和湿度是影响仪器性能的重要因素。他们可以引起机械部件的锈蚀，使金属 镜面的光洁度下降，引起仪 器机械部分的误差或性能下降；造成光学部件如光栅、反射 镜、聚焦镜等的铝膜锈蚀，产生光能不足、杂散光、 噪声等，甚至仪器停止工作，从而 影响仪器寿命。维护保养时应定期加以校正。应严格控制温湿度，特别是地 处南方地区 的实验室。定期清洁，保障环境和仪器室内卫生条件，防尘。仪器使用一定时间后，内部会 积累一定量的尘埃，定期开启仪器外罩对内部进行 除尘工作，同时将各发热元件的散热器重新紧固，对光学盒 的密封窗口进行清洁，必要 时对光路进行校准，对机械部分进行清洁和必要的润滑，最后，恢复原状，再进行 一些 必要的检测、调校与记录。