乳清成分测定方法

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1、干酪副产物乳清特性的影响一、乳清主要成分的测定1、乳清中蛋白质的测定(分光光度法)原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成 硫酸铵，在pH 4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成 黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化毗啶化合物。在波长400 nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质 含量。仪器：(1)分光光度计(2) 电热恒温水浴锅：100 C 0.5 C(3) 10 mL具塞玻璃比色管。(4) 天平：感量为1mg试剂：(1)硫酸铜(CuSO4 5H2O)。(2) 硫酸钾(K SO )4 o2(3) 硫

2、酸(钠S。：密4度为1.84 g/L):优级纯。(5) 对硝基苯酚6%叫)。(6) 乙酸钠(CH COC)Na-33H 0)o(7) 无水乙酸钠3(CHC00Na)o(8) 乙酸(CH C00H)3:优级纯。3(9) 37% 甲醛(HCH0)。(10) 乙酰丙酮(ch。?)。(11) 硫氧化钠溶液300 g/L):称取30 g硫氧化钠加水溶解后，放冷， 并稀释至100mL。(12) 对硝基苯酚指示剂溶液(1 g/L):称取0.1 g对硝基苯酚指示剂溶 于20 mL 95%乙醇中，加水稀释至100mL。(13) 乙酸溶液(1 mol/L):量取5.8 mL乙酸，加水稀释至100 mL。(14)

3、乙酸钠溶液(1 mol/L):称取41 g无水乙酸钠或68 g乙酸钠，加 水溶解后并稀释至500mL。(15) 乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60mL乙酸钠溶液与40mL乙酸溶液混合， 该溶液pH为4.8。(16) 显色剂：15mL甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100 mL，剧烈 振摇混匀(室温下放置稳定3d)。(17) 氨氮标准储备溶液(以氮计)(1.0 g/L):称取105。干燥2 h的 硫酸铵0.4720 g加水溶解后移于100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混 匀，此溶液每毫升相当于1.0 mg氮。(18) 氨氮标准使用溶液(0.1 g/L):用移液管吸取10.00 mL氨氮标准储

4、备液于100mL容量瓶内，加水定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当 于0.1mg氮。实验步骤：(1) 试样消解称取乳清试样1 g5 g (精确至0.001甘)，移入干燥的250 mL定 氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g硫酸钾及5 mL硫酸，摇匀后于瓶口 放一小漏斗，将定氮瓶以45角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热， 待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸， 全液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入 20 mL水，放冷后移入100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液 并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空 白试验。(2) 试样

5、溶液的制备吸取2.00 mL5.00 mL试样或试剂空白消化液于100 mL容量瓶内， 加1滴2滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和全黄 色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。(3) 标准曲线的制备吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL和1.00 mL氨氮标准使用溶液(相当于0.00 p g、5.00 p g、10.0 p g、 20.0 p g、40.0 p g、60.0 p g、80.0 p g 和 100.0 p g 氮)，分别置于 10 mL比色管中。加4.0 mL乙酸钠-乙酸缓冲溶

6、液及4.0 mL显色剂，加水 稀释至刻度，混匀。置于100 C水浴中加热15 min。取出用水冷却全室温后， 移入1 cm比色杯内，以零管为参比，于波长400 nm处测量吸光度值，根据 标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。(4) 试样的测定吸取0.50 mL2.00 mL (约相当于氮100 p g)试样溶液和同量的试 剂空白溶液，分别于10mL比色管中。加4.0 mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100 C水浴中加热15 min。取出 用水冷却全室温后，移入1cm比色杯内，以零管为参比，于波长400 nm处 测量吸光度值，根据标准各点吸光度值

7、。2、乳清中乳糖的测定(酶一比色法)原理：在。-乳糖苷酶催化下，乳糖分解为D-葡萄糖和D-半乳糖。己糖激酶将D- 葡萄糖酸化成6-磷酸葡萄糖，同时将ATP转化为ADP，受6-磷酸葡萄糖脱氢 酶的催化，6-磷酸葡萄糖氧化为6-磷酸葡萄糖酸，同时烟酰胺腺嘌吟二核 苷酸磷酸(NADP+)被还原为还原型烟酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸(NADPH)。 在波长340nm处NADPH的吸光度值与乳糖含量成正比，与标准系列比较定 量。仪器：(1)分析天平：感量0.1mg。(2) 比色管：10mL,带盖。(3) 紫外可见分光光度计(4) 恒温水浴锅试剂：(1) 31g/L亚铁氤化钾溶液：称取3.55g三水亚铁氤化钾(

8、K F (CN) .3HO) 、一 、一.4 e 62溶于水，稀释至100mL，混匀。(2) 40g/L酸锌溶液：称取7.13g七水硫酸锌溶于水，稀释至100mL，混 匀。(3) 2mol/L硫酸溶液：将硫酸加入水中。(4) 4g/L氢氧化钠溶液：称取0.4g氢氧化钠，稀释至100mL，混匀，置于 乙烯塑料品中。(5) 200g/L氢氧化钠溶液：称取20.0g氢氧化钠，稀释至100mL，混匀，置 于乙烯塑料品中(6) 422g/L硫酸铵溶液：称取42.2g硫酸铉荣溶于水，稀释至100mL，混匀。(7) 柠檬酸缓冲液(Ph6.6):称取2.8g二水柠檬酸三钠，0.042g一水柠檬 酸和0.625

9、g七水硫酸镁，溶于40mL水中，混匀。用2mol/L硫酸溶液或 4g/L氢氧化钠溶液将pH调至6.6,定容至50mL，混匀后放置0C-4C冰 箱中，可保存3个月，使用前放置全室温。(8) 三乙醇胺(TEA)缓冲液(pH7.6):称取14.0g三乙醇胺盐酸盐，0.25g 七水硫酸镁溶于80mL水中，用200g/L氢氧化钠溶液将pH调至7.6，稀 释至100mL，混匀后放置0C-4C冰箱中，可保存2个月。(9) NADP+-ATP-TEA缓冲液：称取65mg烟酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸二钠盐 和170mg5-三磷酸腺苷二钠盐(纯度99%-100%)，溶于水30mL三乙 醇胺缓冲液中，混匀后置于0C-4

10、C冰箱中，可保存2个周，使用前放 置全室温。(10) p -GSL- (NH ) SO悬浊液：将。-乳糖苷酶加入422g/L硫酸铵溶液中， 使B -乳糖苷酶得活性不低于60IU/mL，缓冲液搅匀成悬浮液后放置0C -4C冰箱中，可保存12个月.使用时悬浮液的容器应放入冰水中。(11) HK-G6PDH-(NH ) SO :将己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶加入422g/L4 24 硫酸铵溶液，使己糖激酶的活性不低于280IU/mL，6-磷酸葡萄糖脱氢 酶的活性不低于140IU/mL，缓慢搅匀成悬浊液后放置0C-4C冰箱中， 可保存12个月.使用时悬浮液的容器应放入冰水中。(12) 乳糖标准溶液：

11、称取87C干燥至恒重的一水乳糖0.842g，精确到 0.0001g，溶于水中，定溶至100mL，摇匀。准确吸取1.00mL上述溶液， 用水定容至100mL，即得80ug/mL乳糖标准溶液，现用现配。实验步骤：(1) 试液制备用分析天平称取2g乳清，加入20mL40C-50C热水，搅匀成乳浊状 或悬浊液试料，转移至250mL容量瓶。用刻度移液管加入5.0mL亚铁氤化 钾溶液，5.0mL硫酸锌溶液和10mL4g/L氢氧化钠溶液，每次加入后均应 充分摇匀。定容，混匀，静置30min，过滤，弃去最初滤液约30mL。吸 取5.00mL滤液溶于100mL容量瓶中，定容，即为试液。(2) 标准曲线的制备用微

12、量移液管吸取0.00,0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL乳糖标准 溶液,分别置于10mL比色管中，各加入0.20mL柠檬酸缓冲液，0.05mL。 -GSL- (NH ) 2SO悬浊液，摇匀，与36C恒温水浴锅中恒温15min。取出 后加入 1.0l 2NADP+-ATP-TEA缓冲液,0.05m/L HK-G6PDH-(NH ) SO 铵悬浊 液，摇匀，于36C恒温水浴锅中恒温60min。取出后，冷却至室温，用水 定容至5.00mL，摇匀，放置5min。用1cm比色皿，以乳糖标准溶液含量为 0.00的试剂溶液作参比，在波长为340nm处测得各比色管内溶液的吸光 度。以乳糖含量

13、为纵坐标，以吸光度为横坐标，绘制标准曲线。(3) 试液的测定用微量移液管吸取1.00mL试液，置于10mL比色管中，加入0.20mL柠檬 酸缓冲液，1.00mL NADP+-ATP-TEA缓冲液，0.05mL HK-G6PDH-(NH ) SO 悬浊 液，摇匀，于36C恒温水浴锅中恒温60min，取出，冷却全室温，4用水定容 至5.00mL，摇匀。此溶液即为空白溶液。用微量移液管吸取1.00mL试液，置于10mL比色管中各加入0.20mL柠檬 酸缓冲液，0.05mLp -GSL- (NH4) 2SO4悬浊液，摇匀，与36C恒温水浴锅中恒温 15min。取出后加入1.0mL NADP+-ATP-

14、TEA缓冲液，0.05m/LHK-G6PDH-(NH4)2SO4铵悬浊液，摇匀，于36C恒温水浴锅中恒温60min。取 出后，冷却全室温，用水定容至5.00mL，摇匀，放置5min。用1cm比色皿， 以空白溶液作参比，在波长340nm处测定比色管内试液的吸光度，在标准曲 线上查出对应的乳糖含量。3、乳清中脂类的测定(酸水解法)原理：将样品与盐酸溶液一同加热进行水解，是结合或包藏在组织里的脂肪游离 出来，再用乙醚或石油醚提取脂肪，回收溶剂，干燥后称量，提取物的质 量即为脂肪含量。试剂：无水乙醇、无水乙醚、石油醚、盐酸(25:11)仪器：(1)电热恒温水浴锅(2)电热恒温干燥箱(3 )分析天平(4

15、) 比色管(50mL)(5) 具塞量筒(100mL)(6) 称量皿(7) 移液管(10mL)(8) 量筒(50mL)实验步骤：(1) 称取10.00g样品置于50mL比色管中，加10mL盐酸。(2) 将比色管放入7080C水浴中，每隔510 min用玻璃棒搅拌一次，全样品 消化完全为止，时间约需4050 min。水解过程中，如水分蒸发，应适当 补加水，保持溶液总体积不变，以避免酸浓度升高。(3) 脂肪提取：取出比色管，加入10mL乙醇，混合。冷却后将混合物移人100 mL具塞量筒中，用25mL乙醚分次洗试管，洗液一并倒人量筒中。加塞振 摇1 min，小心开塞放出气体，再塞好，静置12 min,

16、小心开塞，用25mL 石油醚一乙醚等量混合液冲洗塞及筒口附着的脂肪。静置1020min。(4 )带上部液体分层清晰后，读出醚层总体积。(5) 准确吸取10mL醚层于已称重的称量皿中，放通风厨中用电吹风使乙醚、 石油醚挥发。(6) 将称量皿放在98100C烘箱中烘至恒重。二、转速对乳清特性的影响取4支离心管分别称取乳清样品5g，分别置于2000r/min，3000 r/min， 4000 r/min， 5000 r/min的转速下离心15min，取其上清液，按照上述方法 分别测出各自蛋白质和乳糖的含量。比较离心前后乳清中蛋白质、乳糖、脂肪 含量的变化。三、温度对乳清特性的影响取6支试管，分别称取

17、乳清样品5g置于其中，然后分别置于30C、40C、 50C、60C、70C、80C的恒温水浴锅中20min，取出后，置于离心管中，在 2000r/min的转速下离心15min，取其上清液，按照上述方法分别测出各自蛋 白质和乳糖的含量。比较离心前后乳清中蛋白质、乳糖、脂肪含量的变化。四、pH对乳清特性的影响取6支离心管分别称取乳清样品5g ,用2mol/L硫酸溶液或4g/L氢氧化 钠溶液将pH分别调至4、5、6、7、8、9,在2000r/min的转速下离心15min, 取其上清液，按照上述方法分别测出各自蛋白质和乳糖的含量。比较离心前后 乳清中蛋白质、脂肪、乳糖含量的变化。五、离子强度对乳清特性的影响分别称取 CaCl2 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0g 溶于100mL水中，用10支烧杯分别称取5g乳清，用移液管分别取2mL上述 CaCl2溶液加入烧杯中，然后置于离心管中，在2000r/min的转速下离心15min， 取其上清液，按照上述方法分别测出各自蛋白质和乳糖的含量。比较离心前后 乳清中蛋白质、脂肪、乳糖含量的变化。