酶工程第三章发酵生产

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1、武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第二章第二章 酶的微生物发酵生产酶的微生物发酵生产本章主要内容：本章主要内容：l酶的生产方法；酶的生产方法；l酶生物合成的基本理论；酶生物合成的基本理论；l发酵产酶的工艺条件及控制；发酵产酶的工艺条件及控制；l酶发酵动力学；酶发酵动力学；l固定化细胞和原生质体发酵产酶固定化细胞和原生质体发酵产酶难点：难点：酶生物合成的诱导和阻遏；酶生物合成的诱导和阻遏；发酵过程细胞生长与酶合成之发酵过程细胞生长与酶合成之间的关系。间的关系。重点：重点：酶生物合成的基本理论；酶生物合成的基本理论；微生物发酵产酶工艺微生物发酵产酶工艺。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第

2、一节第一节 酶的生产方法酶的生产方法l 1894年，美籍日人高峰让吉首先从米曲霉中制备年，美籍日人高峰让吉首先从米曲霉中制备得到高峰淀粉酶（得到高峰淀粉酶（-淀粉酶、他卡酶），用作消化淀粉酶、他卡酶），用作消化剂，开创了近代酶的生产和应用的先例。剂，开创了近代酶的生产和应用的先例。l1908年，德国的罗姆（年，德国的罗姆（Rohm）用动物胰脏制得胰）用动物胰脏制得胰酶，用于皮革的软化。酶，用于皮革的软化。l1908年，法国的波伊定（年，法国的波伊定（Boidin）制备得到细菌）制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的退浆；淀粉酶，用于纺织品的退浆；l1911年，华勒斯坦（年，华勒斯坦（Wallerst

3、ein）从木瓜中获得）从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室l 1949年，日本开始采用微生物液体深层培养方法年，日本开始采用微生物液体深层培养方法进行细菌进行细菌-淀粉酶的发酵生产，揭开了现代酶制剂淀粉酶的发酵生产，揭开了现代酶制剂工业的序幕。工业的序幕。l 20世纪世纪80年代发展起来的动、植物细胞培养技术，年代发展起来的动、植物细胞培养技术，继微生物发酵生产酶之后，已成为酶生产的又一种途继微生物发酵生产酶之后，已成为酶生产的又一种途径。径。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第一节第一节 酶的生产方法酶的生产方法一、酶

4、的生产方法一、酶的生产方法1 1、提取法、提取法 采用各种技术，直接从动、植物细胞或组织中将采用各种技术，直接从动、植物细胞或组织中将酶提取出来。提取法虽简单易行，但受原材料来源的酶提取出来。提取法虽简单易行，但受原材料来源的限制。限制。2 2、化学合成法、化学合成法 是是20世纪世纪60年代中期出现的新技术。年代中期出现的新技术。只能合成那些已知化学结构的酶；成本比较高。只能合成那些已知化学结构的酶；成本比较高。目前仍然停留在实验室内合成的阶段。目前仍然停留在实验室内合成的阶段。牛胃牛胃凝乳酶凝乳酶胰脏胰脏胰酶胰酶血液血液凝血酶凝血酶木瓜木瓜木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶武汉生物工程学院生物工程系酶工

5、程教研室3 3、微生物发酵法、微生物发酵法 是是20世纪世纪50年代以来生产酶的主要方法。年代以来生产酶的主要方法。利用微生物细胞的生命活动合成所需酶的方法称利用微生物细胞的生命活动合成所需酶的方法称为发酵法。为发酵法。酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室二、应用微生物来开发酶的优点二、应用微生物来开发酶的优点1、微生物种类多，酶种丰富；、微生物种类多，酶种丰富；2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶；、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶；3、微生物培养基来源广泛，价格便宜；、微生物培养基来源广泛，价格便宜；

6、4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程；、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程；5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室三、酶发酵生产的类型三、酶发酵生产的类型1 1、液体深层发酵：、液体深层发酵：液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件下发酵。2 2、固体培养发酵、固

7、体培养发酵 培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌株，在一定条件下发酵。3 3、固定化细胞发酵（、固定化细胞发酵（7070年代后期发展）年代后期发展）将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。4 4、固定化原生质体发酵（、固定化原生质体发酵（8080年代中期发展）年代中期发展）原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第二节第二节 酶生物合成的基本理论酶生物合成的基本理论一、酶生物合成的过程一、酶生物合成的过程DNADNARNARNA蛋白质（新生多肽链）蛋白质（新生多肽链）成熟蛋白质（酶）成熟蛋白质（酶）胞内胞内胞外胞外转录翻译加工分泌或定位

8、武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节 按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类：按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类：组成酶组成酶恒定（速度、浓度）恒定（速度、浓度）诱导酶诱导酶在外界环境因素诱导下合成速在外界环境因素诱导下合成速度急增，酶浓度成百上千倍增度急增，酶浓度成百上千倍增加加(适应型酶、调节型酶)武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室酶合成的基因调控类型：酶合成的基因调控类型：诱导诱导和和阻遏阻遏1 1、酶合成的诱导作用、酶合成的诱导作用 加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，

9、称为诱导作用。诱导作用。诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。例：乳糖诱导例：乳糖诱导-半乳糖苷酶的合成半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导淀粉诱导a-a-淀粉酶的合成淀粉酶的合成武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2 2、酶合成的阻遏、酶合成的阻遏（1 1）终产物阻遏）终产物阻遏 指酶催化反应的产物或代谢途指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。到阻遏的现象。（2 2）分解代谢物阻遏（营养源阻遏）分解代谢物阻遏（营养源阻遏）是指某些物质经过分解代谢产生的

10、物质是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。阻遏其他酶合成的现象。葡萄糖阻遏葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的生物合成半乳糖苷酶的生物合成 果糖阻遏果糖阻遏a-a-淀粉酶的生物合成淀粉酶的生物合成A1 B1A2 B2EA BE色氨酸过量时会阻遏催化色氨酸合成的相关酶色氨酸过量时会阻遏催化色氨酸合成的相关酶武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第三节第三节 微生物发酵产酶工艺微生物发酵产酶工艺（重点）（重点）发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种提供适当的营养提供适当的营养和生长环境和生长环境，使生产菌，使生产菌大量增

11、殖大量增殖，同时，同时合成所需要的酶合成所需要的酶，然后，然后由发酵所得物料制成酶产品。由发酵所得物料制成酶产品。现代酶制剂的大规模生产以现代酶制剂的大规模生产以深层液体发酵法深层液体发酵法为主。为主。无论哪种发酵法，都要做三方面的工作：无论哪种发酵法，都要做三方面的工作：（1 1）从原料准备培养基；）从原料准备培养基；（2 2）从原始菌种准备生产菌种；）从原始菌种准备生产菌种；（3 3）发酵过程管理。）发酵过程管理。一、发酵产酶的一般工艺流程一、发酵产酶的一般工艺流程武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室 原原 料料 原始菌种原始菌种 麸皮等原料麸皮等原料 饼粕等原料饼粕等原料 淀粉质原料淀

12、粉质原料 试管斜面培养试管斜面培养(活化)配制培养基配制培养基 (灭菌灭菌)按不同原料按不同原料 净化、粉碎净化、粉碎 摇瓶等分级扩大培养摇瓶等分级扩大培养作不同处理作不同处理 水解水解 种子罐培养种子罐培养 淀粉糖液淀粉糖液 发酵罐发酵罐(液体发酵液体发酵)发酵池发酵池(固体发酵固体发酵)培养 配制培养基配制培养基 (灭菌灭菌)发酵液发酵液 成品曲成品曲 下游加工 液态酶制剂液态酶制剂 固体粗酶制剂固体粗酶制剂 各种精制酶制剂各种精制酶制剂 酶发酵生产的一般工艺流程图酶发酵生产的一般工艺流程图武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室保藏菌种保藏菌种 试管斜面培养（活化）试管斜面培养（活化）摇瓶

13、扩大培养摇瓶扩大培养种子罐培养种子罐培养发酵罐发酵罐分离纯化分离纯化酶酶培养基培养基无菌空气无菌空气武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室 二、酶生产菌种二、酶生产菌种（一）产酶菌种的要求（一）产酶菌种的要求（1 1）产酶量高；）产酶量高；（2 2）繁殖快，发酵周期短；）繁殖快，发酵周期短；（3 3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；（4 4）能够利用廉价原料，容易培养和管理；）能够利用廉价原料，容易培养和管理；（5 5）安全性可靠，非致病菌）安全性可靠，非致病菌。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室新开发的酶必须按规定进行下表的各项检查新开发的酶必须

14、按规定进行下表的各项检查项目项目试验动物试验动物急性中毒急性中毒鼠鼠,大白鼠大白鼠口服口服 4周周大白鼠大白鼠12月月狗狗致癌试验致癌试验:24月月两重啮齿动物两重啮齿动物畸胚组织发生试验畸胚组织发生试验(24月月)两重啮齿动物两重啮齿动物生产病原性试验生产病原性试验四种动物四种动物皮肤刺激性试验皮肤刺激性试验(肤肤,眼眼)兔子兔子,人人抗原性抗原性人人武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（二）、常用的产酶微生物（二）、常用的产酶微生物1 1、细菌、细菌大肠杆菌大肠杆菌 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、天冬酰胺酶、-半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶

15、等。枯草杆菌枯草杆菌 -淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶、5-核苷酸酶、碱性磷酸酶。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2 2、放线菌、放线菌 链霉菌：链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室3 3、霉菌、霉菌 黑曲霉黑曲霉：糖化酶、-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。米曲霉：米曲霉：氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。红曲霉：红曲霉：-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。青霉：青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶等。木霉：木霉：纤维素酶。根霉：根霉：糖化酶、蔗糖

16、酶、碱性蛋白酶，脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。毛霉：毛霉：蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室4 4、酵母、酵母 啤酒酵母啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。假丝酵母：假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢酶等。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室 工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源酶酶产酶微生物产酶微生物用途用途-淀粉酶淀粉酶枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌地衣芽胞杆菌地衣芽胞杆菌米曲霉米曲霉淀粉液化，织物退浆，消化淀粉液化，织物退浆，消化助剂，加酶洗涤剂助剂，加酶洗涤剂葡萄糖淀粉

17、酶葡萄糖淀粉酶米曲霉，黑曲霉，米曲霉，黑曲霉，米根霉米根霉制造葡萄糖，发酵、酿酒等制造葡萄糖，发酵、酿酒等工业的淀粉水解糖工业的淀粉水解糖中性蛋白酶中性蛋白酶枯草芽胞杆菌，米枯草芽胞杆菌，米曲霉曲霉皮革、毛皮加工，食品加工，皮革、毛皮加工，食品加工，调味品制造、助消化、消炎、调味品制造、助消化、消炎、啤酒澄清啤酒澄清碱性蛋白酶碱性蛋白酶地衣芽胞杆菌地衣芽胞杆菌加酶洗涤剂加酶洗涤剂植酸酶植酸酶黑曲霉，毕赤酵母黑曲霉，毕赤酵母工程菌株工程菌株饲料添加剂饲料添加剂武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室纤维素酶纤维素酶里氏木霉、黑曲霉里氏木霉、黑曲霉水洗布生产，饲料添加剂，水洗布生产，饲料添加剂，消化

18、植物细胞壁消化植物细胞壁半纤维素半纤维素酶酶木霉、曲霉、根霉木霉、曲霉、根霉饲料添加剂，消化植物细胞饲料添加剂，消化植物细胞壁，低聚木糖生产壁，低聚木糖生产-葡聚糖葡聚糖酶酶枯草芽胞杆菌，黑曲枯草芽胞杆菌，黑曲霉，霉，Penicillium emersonii啤酒酿造，饲料添加剂啤酒酿造，饲料添加剂异淀粉酶异淀粉酶产气克雷伯氏菌，芽产气克雷伯氏菌，芽孢杆菌孢杆菌淀粉加工淀粉加工乳糖酶乳糖酶乳酸酵母，米曲霉，乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉黑曲霉，米根霉乳品工业（处理牛乳和乳清）乳品工业（处理牛乳和乳清）工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源武汉生物工程学院

19、生物工程系酶工程教研室转化酶转化酶啤酒酵母、假丝酵母啤酒酵母、假丝酵母制造转化糖制造转化糖凝乳酶凝乳酶米赫毛霉米赫毛霉,大肠杆菌和真大肠杆菌和真菌生产的重组酶菌生产的重组酶制造乳酪制造乳酪脂肪酶脂肪酶曲霉、根霉、酵母等曲霉、根霉、酵母等加酶洗涤剂，油脂加工，加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工生物化工葡萄糖氧葡萄糖氧化酶化酶青霉、曲霉青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖，测食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖定葡萄糖葡萄糖异葡萄糖异构酶构酶凝结芽胞杆菌，白色链凝结芽胞杆菌，白色链霉菌霉菌生产果葡糖浆生产果葡糖浆青霉素酰青霉素酰化酶化酶细菌、霉菌、放线菌细菌、霉菌、放线菌制造制造6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸 工业规

20、模应用的微生物酶和它们的某些来源工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（三（三 ）生产菌种的来源）生产菌种的来源1 1、买，专利、买，专利 向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。中国工业微生物菌种保藏中心（中国工业微生物菌种保藏中心（CICCCICC）；）；中国典型培养物保藏中心（中国典型培养物保藏中心（CCTCCCCTCC，又称武大保藏中心）。，又称武大保藏中心）。中国农业微生物菌种保藏中心（中国农业微生物菌种保藏中心（ACCCACCC）；）；中国普通微生物菌种保藏管理中心（中国普通微生物菌种保藏

21、管理中心（CGMCCCGMCC）美国典型微生物菌种保藏中心（美国典型微生物菌种保藏中心（ATCCATCC）荷兰微生物菌种保藏中心（荷兰微生物菌种保藏中心（CBSCBS）德国微生物菌种保藏中心（德国微生物菌种保藏中心（DSMZDSMZ）英国国家典型菌种保藏所（英国国家典型菌种保藏所（NCTCNCTC）武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（1 1）样品的采集：主要是各种富含所需微生物的土壤、水、）样品的采集：主要是各种富含所需微生物的土壤、水、气、枯枝烂叶、烂水果等气、枯枝烂叶、烂水果等 ；产酶菌种筛选步骤：产酶菌种筛选步骤：2 2、筛选、筛选 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进由

22、自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选行分离筛选 。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（2 2）初筛：分离产目的酶的菌株；）初筛：分离产目的酶的菌株；给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株分离出来。-淀粉酶的筛选淀粉酶的筛选蛋白蛋白酶的筛选酶的筛选武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（3 3）复筛：从所得菌株中筛选优良株；）复筛：从所得菌株中筛选优良株；在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。诱变育种 细胞杂交原生质体融合育种 基因工程育种（4 4）高产菌株的选育。）高产菌株的选育。武汉生物工程学院生物工程系酶工

23、程教研室（四）产酶菌种的保存（四）产酶菌种的保存 保藏方法保藏方法:斜面保藏法斜面保藏法,沙土保藏法沙土保藏法,真空冷冻干燥真空冷冻干燥保藏法保藏法.低温保藏法低温保藏法,石蜡油保藏法等石蜡油保藏法等.武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（五）生产种子的制备（五）生产种子的制备 生产种子：生产种子：由原始保藏菌种，经过由原始保藏菌种，经过活化活化，扩大培养扩大培养，用，用于发酵罐接种的大量菌体。于发酵罐接种的大量菌体。1 1、种子制备工艺过程、种子制备工艺过程保藏菌种保藏菌种活化培养活化培养逐级摇瓶培养逐级摇瓶培养种子罐培养种子罐培养接种至发酵罐接种至发酵罐武汉生物工程学院生物工程系酶工程教

24、研室（1 1）菌种活化）菌种活化 目的：目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以恢复细胞的生命活动能力恢复细胞的生命活动能力。方法：在试管斜面上培养方法：在试管斜面上培养1-31-3代。代。（2 2）扩大培养）扩大培养 目的：目的：活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，以获得以获得足够数量足够数量的的优质优质细胞。细胞。培养基称为种子培养基。培养基称为种子培养基。方法：分为实验室培养和车间培养两个阶段。方法：分为实验室培养和车间

25、培养两个阶段。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室扩大培养应注意的事项：扩大培养应注意的事项：（1）尽量减少传代次数，以降低菌种衰退和污染的可能性；（2）培养基成分一般应比发酵培养基的氮源丰富；（3）培养时间一般控制在微生物生长的对数生长期，及时接入下一级培养或发酵罐；（4）严格控制培养条件（pH、温度、通气量等），加强培养过程的实时监测。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室三三 、培养基、培养基1 1、碳源、碳源：提供碳元素；能源。提供碳元素；能源。碳源碳源、氮源氮源、无机盐无机盐、生长因素生长因素、水水等。等。来源：淀粉及其水解物来源：淀粉及其水解物淀粉水解糖、糖蜜、或含淀粉的淀粉水解

26、糖、糖蜜、或含淀粉的原料如大米、薯类、玉米、麸皮、米糠等。原料如大米、薯类、玉米、麸皮、米糠等。此外石油产品中此外石油产品中1212碳碳1616碳的碳氢化合物已成功用作微生碳的碳氢化合物已成功用作微生物培养基的碳源。物培养基的碳源。注意注意：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。培养基培养基是人工配制的供微生物生长、繁殖及合成酶的营养是人工配制的供微生物生长、繁殖及合成酶的营养物质的混合物。物质的混合物。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2

27、 2、氮源：、氮源：提供氮元素。提供氮元素。来源：来源：有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等；副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等；无机氮：含氮的无机化合物，如（无机氮：含氮的无机化合物，如（NHNH4 4）2 2SO4SO4、NHNH4 4NONO3 3、NaNONaNO3 3和（和（NHNH4 4）3 3POPO4 4等。等。3 3、无机盐：、无机盐：大量元素和微量元素大量元素和微量元素。基本功能：构成细胞的成分；基本功能：构成细胞的成分；构成酶产品的组分；构成酶产品的组分；作为酶的激活剂。作为酶的激活剂。武汉生物工程学院生物

28、工程系酶工程教研室4 4、生长因子、生长因子 指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等三类物质。种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等三类物质。酶制剂中所用的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉酶制剂中所用的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、麸皮、米糠、酵母膏等。米浆、麦芽汁、豆芽汁、麸皮、米糠、酵母膏等。5 5、水、水武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室配制培养基的注意事项配制培养基的注意事项：（1）培养基的碳氮比是培养基成分配比的重点；（2）碳源和氮源的选择，要注意避免碳分解代谢阻遏

29、和氮分解代谢阻遏；（3）培养基中无机盐的选择要注意盐类引起的生理酸碱性反应；（4）发酵生产所用的培养基成分配比不可轻易改变。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室微生物发酵产酶培养基举例微生物发酵产酶培养基举例1、枯草杆菌、枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基：淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%豆饼粉 4%磷酸氢二钠 0.8%硫酸铵 0.4%氯化钙 0.2%氯化铵 0.15%自然pH武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2、黑曲霉糖化酶发酵培养基、黑曲霉糖化酶发酵培养基 玉米粉 10%豆饼 4%麸皮 1%pH 4.45.0武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（二）培养基的种类（二）培养基的种类

30、1 1、斜面培养基：、斜面培养基：是供菌种生长繁殖使用的。2 2、种子培养基：、种子培养基：是供菌种生长繁殖使用的。3 3、发酵培养：、发酵培养：是供菌种生长繁殖和发酵产物合成之用。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室四、发酵条件的控制四、发酵条件的控制影响产酶的几个重要条件影响产酶的几个重要条件1 1、温度的调节控制、温度的调节控制（2）有些微生物）有些微生物生长最适温度生长最适温度与与发酵产酶的最适温度发酵产酶的最适温度有所不有所不同。同。例：例：酱油曲霉生产蛋白酶，酱油曲霉生产蛋白酶，28时蛋白酶产量比在时蛋白酶产量比在40 条件条件下高下高24倍，在倍，在20条件下发酵，则蛋白酶产量

31、更高，但细胞条件下发酵，则蛋白酶产量更高，但细胞生长速率较慢。生长速率较慢。为此为此，在有些酶的发酵生产过程中，在有些酶的发酵生产过程中，要在不同的发酵阶段要在不同的发酵阶段控制不同的温度控制不同的温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。（1）不同的微生物有不同的最适生长温度。）不同的微生物有不同的最适生长温度。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（3）温度的控制方法）温度的控制方法 一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有一般采用热水升温，冷水降温。因此

32、，在发酵罐中均设有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2 2、pHpH值的调节控制值的调节控制（1）不同微生物，其生长繁殖的最适）不同微生物，其生长繁殖的最适pH值有所不同。值有所不同。（2）微生物生长的最适微生物生长的最适pH值与产酶最适值与产酶最适pH值往往不同。值往往不同。（3）有些微生物可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过）有些微生物可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的控制培养基的pH，往往可以改变各种酶之间的产量比

33、例。，往往可以改变各种酶之间的产量比例。黑曲霉黑曲霉 -淀粉酶淀粉酶 糖化酶糖化酶pHpH值中性值中性 pH pH值偏酸性值偏酸性 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（4 4）影响）影响pHpH值的因素值的因素一般来说，培养基成分中一般来说，培养基成分中C/NC/N比高比高，发酵液倾向于，发酵液倾向于酸性酸性，pHpH低；低；C/NC/N比低比低，发酵液倾向于，发酵液倾向于碱性碱性，pHpH高。高。不同盐的利用对不同盐的利用对pHpH也会产生影响。也会产生影响。（5 5）生产中控制）生产中控制pHpH值的方法值的方法添加添加缓冲液缓冲液维持一定的维持一定的pHpH值（如磷酸盐）；值（如磷酸

34、盐）；调节培养基的调节培养基的原始原始pHpH，保持一定的，保持一定的C/NC/N比比；发酵液中发酵液中pHpH过高，加过高，加糖或淀粉糖或淀粉来调节。反之，加来调节。反之，加尿素尿素或液氨或液氨；pHpH值还与通气量有关。值还与通气量有关。通过调节通过调节通气量通气量来实现；来实现；加加酸酸、碱碱。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室3 3、溶解氧的调节控制、溶解氧的调节控制 溶解氧溶解氧指溶解在培养基中的氧。微生物一般只能利用溶指溶解在培养基中的氧。微生物一般只能利用溶解氧。解氧。l调节溶氧速率的方法调节溶氧速率的方法（1 1）调节通气量；）调节通气量；（2 2）调节氧的分压；）调节氧的

35、分压；（3 3）调节气液接触时间；）调节气液接触时间；（4 4）调节气液接触面积；）调节气液接触面积；（5 5）改变培养液性质。）改变培养液性质。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室5 5、湿度的调节控制、湿度的调节控制 用固体培养基生产酶制剂时，一般前期湿度低些，培养后期湿度大些，有利于产酶。4 4、泡沫、泡沫l形成：通气搅拌、培养基中某些成分的变化、代谢产生的气体。l危害：阻碍CO2的排除，影响氧的溶解；引起染菌。l消泡方法：机械消泡、化学消泡。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室五、提高酶产量的措施五、提高酶

36、产量的措施（一）添加诱导物（一）添加诱导物 诱导酶的发酵生产，添加酶合成的诱导物，可以显著提高诱导酶的发酵生产，添加酶合成的诱导物，可以显著提高酶产量。酶产量。1 1、不同的酶有各自不同的诱导物；但有时一种诱导物可诱导、不同的酶有各自不同的诱导物；但有时一种诱导物可诱导生成同一酶系的若干种酶；同一种酶往往有多种诱导物。生成同一酶系的若干种酶；同一种酶往往有多种诱导物。3 3、诱导物的浓度：、诱导物的浓度：必须控制在适当浓度。必须控制在适当浓度。2 2、诱导物的分类、诱导物的分类 （1 1）酶作用的底物；）酶作用的底物；（2 2）酶作用底物的类似物；）酶作用底物的类似物；（3 3）酶的反应产物；

37、）酶的反应产物；（4 4）底物和底物类似物的前体物。）底物和底物类似物的前体物。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（二）控制阻遏物的浓度（二）控制阻遏物的浓度1 1、解除终产物阻遏的方法、解除终产物阻遏的方法降低培养基中酶作用产物的浓度；降低培养基中酶作用产物的浓度；添加终产物的类似物。添加终产物的类似物。2 2、解除分解代谢产物阻遏的方法、解除分解代谢产物阻遏的方法控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源浓度，可采用其他较控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源浓度，可采用其他较难利用的碳源（如淀粉等），或采用补料，分次流加碳源等方难利用的碳源（如淀粉等），或采用补料，分次流加碳源等方法，以控制碳源

38、浓度在较低的水平，以利于酶产量的提高；法，以控制碳源浓度在较低的水平，以利于酶产量的提高；添加一定量的环腺苷酸（添加一定量的环腺苷酸（cAMPcAMP），可以解除分解代谢物阻遏），可以解除分解代谢物阻遏作用。作用。P P3939武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（三）通过基因突变提高酶产量（三）通过基因突变提高酶产量使诱导型变成组成型；使诱导型变成组成型；使阻遏型变成去阻遏型。使阻遏型变成去阻遏型。（四）其他提高酶产量的方法（四）其他提高酶产量的方法1 1、添加细胞渗漏增强物：、添加细胞渗漏增强物：如吐温（如吐温（TweenTween）、催通（）、催通（TritonTriton）等。）等。

39、在培养基中添加在培养基中添加1%的吐温（的吐温（Tween），可使纤维素酶的产），可使纤维素酶的产量提高量提高1020倍。倍。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2 2、其他产酶促进剂、其他产酶促进剂 植酸钙植酸钙 ：霉菌蛋白酶或橘青磷酸二酯酶 120倍 聚乙烯醇聚乙烯醇 衍生物衍生物 ：可防止霉菌菌丝结球，提高糖化酶产量 聚乙烯醇聚乙烯醇、醋酸钠等、醋酸钠等 ：纤维素酶 这些物质的实际效果明显，但作用机制还需深入探讨。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第四节第四节 酶发酵动力学酶发酵动力学 研究发酵过程中细胞生长速度研究发酵过程中细胞生长速度,产物

40、生成速度及环境因产物生成速度及环境因素对这些速度的影响。素对这些速度的影响。酶发酵动力学研究意义酶发酵动力学研究意义:了解酶生物合成模式；了解酶生物合成模式；发酵工艺条件优化控制；发酵工艺条件优化控制；提高酶产量。提高酶产量。本节主要内容本节主要内容:一、酶生物合成的模式一、酶生物合成的模式二、细胞生长动力学二、细胞生长动力学三、产酶动力学三、产酶动力学武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室一、微生物生长曲线一、微生物生长曲线 （Microbial growth curve）调调整整期期对对数数生生长长期期平平衡衡期期衰衰亡亡期期时间时间细细胞胞数数量量的的对对数数武汉生物工程学院生物工程系酶

41、工程教研室二、酶的生物合成模式二、酶的生物合成模式酶的生物合成模式可发分为酶的生物合成模式可发分为4 4种类型：种类型：（1 1）同步合成型）同步合成型（2 2）中期合成型）中期合成型（3 3）延续合成型）延续合成型（4 4）滞后合成型）滞后合成型武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室1 1、同步合成型、同步合成型l酶的生物合成与细胞生长酶的生物合成与细胞生长同步进行同步进行，又称生长偶联型。，又称生长偶联型。特点：特点：（1 1）发酵开始，细胞生长，）发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明酶也开始合成，说明不受分解不受分解代谢物和终产物阻遏代谢物和终产物阻遏。（2 2）生长至平衡期后，酶浓）

42、生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明度不再增长，说明mRNAmRNA很不稳很不稳定定。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2 2、中期合成型、中期合成型l酶的合成在酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始细胞生长一段时间以后才开始，而进入细胞平衡，而进入细胞平衡期后，酶的合成也终止。期后，酶的合成也终止。特点：特点：（1 1）该类酶的合成）该类酶的合成受分解代受分解代谢物阻遏谢物阻遏。（2 2）该酶对应的）该酶对应的mRNAmRNA不稳定不稳定。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室3 3、延续合成型、延续合成型l酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞进入酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞进

43、入平衡期后平衡期后，酶还可以酶还可以延续合成延续合成较长的一段时间。较长的一段时间。特点：特点：（1 1）该类酶）该类酶不受分解代谢产物不受分解代谢产物阻遏阻遏和和终产物阻遏终产物阻遏。（2 2）该酶对应的）该酶对应的mRNAmRNA是相当是相当稳定稳定的。的。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室4 4、滞后合成型、滞后合成型l只有当细胞生长进入只有当细胞生长进入平衡期平衡期后，后，酶才开始合成酶才开始合成。又。又称非生长偶联型。称非生长偶联型。特点：特点：（1 1）该类酶）该类酶受分解代谢物受分解代谢物阻遏阻遏作用的影响，阻遏解除作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。后，酶才大量合成。（2

44、 2）该酶对应的）该酶对应的mRNAmRNA稳定稳定性高性高。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室时间时间(h)图图3-1 3-1 酶生物合成模式酶生物合成模式 A.A.同步合成型同步合成型;B.;B.中期合成型中期合成型;C.;C.延续合成型延续合成型;D.;D.滞后合成型滞后合成型浓度浓度细胞浓度酶浓度酶浓度酶浓度细胞浓度细胞浓度ABD细胞浓度酶浓度C武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室小结：小结：l影响酶生物合成模式的影响酶生物合成模式的主要因素主要因素：培养基中：培养基中阻遏物的存在阻遏物的存在和和mRNAmRNA的稳定性的稳定性。（1 1）不受不受培养基中某种物质培养基中某种物质

45、阻遏阻遏时，可随着细胞生长而开始时，可随着细胞生长而开始合成；合成；受阻遏的酶受阻遏的酶，要在细胞生长一段时间或进入平衡期后，要在细胞生长一段时间或进入平衡期后，解除阻遏，酶才开始合成。解除阻遏，酶才开始合成。（2 2）mRNAmRNA稳定性高稳定性高的，可在细胞停止生长后继续合成其对的，可在细胞停止生长后继续合成其对应的酶；应的酶；稳定性差的稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成。，随着细胞生长停止而终止酶的合成。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室 选择选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是周期，最理想的合

46、成模式是延续合成型延续合成型。改造改造非理想模式：在细胞选育上下功夫，并适当调节工艺非理想模式：在细胞选育上下功夫，并适当调节工艺条件：条件：（1 1）同步合成型：）同步合成型：适当降低发酵温度，尽量适当降低发酵温度，尽量提高提高酶所对应的酶所对应的mRNAmRNA的稳定性的稳定性。（2 2）中期合成型：）中期合成型：要从要从解除阻遏解除阻遏和和提高提高mRNAmRNA的稳定性的稳定性两方面进行努力。两方面进行努力。（3 3）滞后合成型）滞后合成型 在发酵过程中要尽量在发酵过程中要尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏减少甚至解除分解代谢物阻遏，使，使酶的合成提早开始。酶的合成提早开始。选择与改造选择

47、与改造武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室三、细胞生长动力学三、细胞生长动力学 细胞生长动力学主要研究细胞生长速度及外界因素对其影响的规律。在发酵过程优化及发酵过程控制等方面具有重要的应用价值。Monod Monod认为，在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度认为，在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比：成正比：R Rx x=d dX Xd dt t=XXRx生长速率，单位时间内细胞浓度的增加值，mg/mL.min，g/L.hX细胞浓度，mg/mL，g/L比生长速率，生长速率与细胞浓度之比（单位细胞在单位时间内浓度增加值），h-1武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室若培养基中只有一种限制

48、性基质时，为此限制性基质浓度的函数：微生物生长动力学模型（后人称微生物生长动力学模型（后人称MonodMonod方程）：方程）：=maxmaxS SK Ks s+S+SS限制性基质浓度，mol/L，g/Lmax最大比生长速率，限制性基质浓度过量时的比生长速率KsMonod常数，=1/2 max时，Ks=S 限制性基质：指对发酵起决定性作用的基质成分，通常是碳源物质。只考虑限制性基质，可简化数学分析。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室 Monod Monod方程是基本的细胞生长动力学方程方程是基本的细胞生长动力学方程;从不同情况出发从不同情况出发对其进行修饰对其进行修饰.连续全混流反应器发酵

49、过程中连续全混流反应器发酵过程中,稳态时游离细胞连续发稳态时游离细胞连续发酵的生长动力学方程酵的生长动力学方程:D=0 D=0 时时,分批发酵分批发酵;D D D 时，细胞浓度下降时，细胞浓度下降,S,S升高升高,回升回升;D max D max 时，时，X X趋于零趋于零;R Rx x=d dX Xd dt tmaxmaxS SK Ks s+S+S=X X-DX=DX=（-D-D）X X=D=D是连续发酵反应器稳定运行的必要条件。是连续发酵反应器稳定运行的必要条件。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室四、产酶动力学四、产酶动力学宏观酶合成速度方程：宏观酶合成速度方程：1、生长偶联型：包括同步合成型和中间合成型。d dE Ed dt tX X=XX 为比例常数，命名为生长偶联的比产酶系数。对于中间合成型来说，生长初期，=0，无酶合成，即是受阻遏阶段。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2、非生长偶联型：滞后合成型d dE Ed dt t X X=X X 为比例常数，命名为非生长偶联的比产酶速率。3、部分生长偶联型：延续合成型d dE Ed dt t=X X+XX=（+）X X