T细胞激活剂对Jurkat细胞重组激活基因表达的影响

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1、T细胞激活剂对Jurkat细胞重组激活 基因表达的影响【关键词】T细胞激活剂，；Jurkat细胞；重组激活基因；逆转录聚合酶链 反应【Abstract】 AIM: To investigate the effects of T cell activators on the mRNA expression of recombinationactivating genes (RAGs) in Jurkat cells. METHODS: After Jurkat cells were treated with PHA (20 mg/L), antiCD3 mAb (1：100)，PMA(40 ug

2、/L)+A23187 (0.5 umol/L) for 6 and 12 h respectively, RAG1 and RAG2 mRNA were measured by RTPCR. Semiquantitative analysis was used to evaluate RAG1 and RAG2 mRNA levels in different groups. RESULTS: Compared with the control groups, the levels of RAG1 mRNA were significantly lower in different treat

3、ed groups (P0.05)，and RAG1 mRNA levels were associated with treatment time. RAG2 mRNA levels in PHA treated groups were significantly lower than those in the control groups (P0.05). No RAG2 mRNA was detected in PMA+A23187 treated groups. However, RAG2 mRNA level was significantly higher in antiCD3 m

4、Ab (12 h) treated group than that in control groups(P0.05). CONCLUSION： RAG1 and RAG2 mRNA were coexpressed in Jurkat cells and could be regulated by T cell activators. The results may give a clue that Jurkat cells maybe provide an ideal cell line model for studying the regulation of RAGs in periphe

5、ral T cells.Keywords T cell activators; Jurkat cells; recombinationactivating genes; reverse transcriptase polymerase chain reaction【摘要】目的：研究丁细胞激活剂PHA，抗CD3 mAb, PMA+A23187对 人T细胞白血病细胞株Jurkat重组激活基因(RAGs ) mRNA表达水平的影响.方 法：采用RTPCR法检测不同T细胞激活剂作用不同时间后Jurkat细胞中RAG1， RAG2 mRNA，以B肌动蛋白(Bactin)的表达作为内参照进行灰度分析，比较

6、不 同组Jurkat细胞RAGs mRNA的表达水平.结果：三种T细胞激活剂刺激诱导的 Jurkat细胞RAG1 mRNA表达量明显低于对照组(P0.05)，且RAG1 mRNA表达量 的下降与刺激诱导作用时间有关；PHA刺激诱导后RAG2表达量显著低于对照组 (P0.05)； PMA+A23187刺激诱导6， 12 h均未检测出RAG2 mRNA的表达； 而 抗CD3 mAb作用12 h组RAG2 mRNA表达量显著高于对照组(P0.05).结论： Jurkat细胞同时表达RAG1， RAG2 mRNA，并在一定诱导下RAGs表达量发生改变， 因此有可能成为研究外周T细胞RAGs表达调节的一

7、个潜在的细胞模型.【关键词】T细胞激活剂；Jurkat细胞；重组激活基因；逆转录聚合酶链反应淋巴细胞特异性重组激活基因（recombination activating genes， RAG）1和RAG2是参与V（D）J重排和功能性抗原受体基因形成的一个首要条件 1. 一般认为，RAG1, RAG2基因仅特异性地同时表达于淋巴细胞发育的早期阶 段，而不表达于淋巴细胞分化发育的较成熟阶段.然而，近年的研究发现，外周成 熟淋巴细胞中也有RAGs表达和V（D）J重排的发生2-3.迄今，外周淋巴细胞 RAGs mRNA的表达和调节机制仍不清楚.本研究以代表T细胞发育成熟阶段的人T 细胞白血病细胞株Ju

8、rkat细胞为研究对象，检测其RAG1和RAG2 mRNA的共表达情 况，探讨T细胞激活剂对Jurkat细胞RAGs mRNA表达水平的影响，为研究外周T 细胞的RAGs表达调节机制奠定基础.1材料和方法1.1材料Jurkat细胞株购自上海细胞生物研究所（clone E61， ATCC Number TIB152， TCRaB+CD3+CD4+CD8CD2+CD7+）.分泌抗 CD3 mAb 的杂交瘤细胞 株12F6由南方医科大学分子免疫学研究所冻存.RPIM 1640培养基（美国GIBCO 公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；植物血凝素 （Phytohemagglutinin， PH

9、A广东医药工业研究所产品）；佛波醇12豆蔻酰13乙 酸酯（Phorbol 12Myristate 13Acetate， PMA），钙离子载体 A23187 （美国 Sigma 公司）；总RNA提取试剂盒（安徽优晶生物工程有限公司）；RNA逆转录试剂盒 （日本TOYOBO公司）；Taq DNA聚合酶（立陶宛MBI Fermentas公司）；pUCmT 载体（上海生工生物工程技术服务有限公司）；DL2000 DNA Marker （TaKaRa大连 宝生物有限公司）.1.2方法1.2.1细胞培养、处理及总RNA提取Jurkat细胞用含有100 mL/L胎牛血 清的RPMI 1640培养基于37 C

10、，50 mL/L CO2条件下培养.将对数生长期的 Jurkat细胞，按1X109/L的密度培养于12孔板中，分别加入PHA （20 mg/L）， 抗 CD3 mAb （1：100）， PMA （40 ug/L） +A23187 （0.5 umol/L），同时设不加 任何处理因素的对照组，每组均设3个复孔，分别在培养的第6，12 h，收集各组细胞，PBS洗涤23次后采用试剂盒提取细胞总RNA，在核酸蛋白分析仪 （BECKMAN DU530） 上鉴定RNA纯度和浓度，-70C冻存备用.1.2.2RNA逆转录取样品总RNA约1 ug，加到20 uL反应体系中按试剂 盒说明进行逆转录.1.2.3PC

11、R扩增RAG1， RAG2 mRNAPCR引物由上海博亚生物技术有限公司 合成.RAG1 上下游引物序列分别为：5，GAGCAAGGTACCTCAGCCAG3， 5ZGAGGCATCTGAGAATGCAG 3，扩增片段长度为 984 bp，PCR 反应条件为 94C 2 min；94C 30 s， 58C 45 s，72C 1 min，30 个循环；RAG2 上下游引物序列分 别为：5ATACCTGGTTTAGCGGCAAA3, 5CCAGCCTTTTTGTCCAAAGAA 3, 扩增片 段长度为 192 bp,反应条件为 94C 2 min；94C 15 s,60C 20 s,72C 45

12、s, 30个循环；Bactin上下游引物序列分别为：5ACATTAAGGAGAAGCTGTGC3, 5CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT3, 扩增片段长度 375 bp. Bactin 与 RAG 1 或 RAG2在同一反应体系中扩增.PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，漠化乙锭染色 后采用凝胶成像系统（BIORAD Gel Dox XR system）照相.1.2.4PCR产物的克隆和序列分析切胶回收并纯化PCR目的产物条带，将 之与pUCmT载体连接后转化DH5a感受态菌，采用a互补实验挑选阳性克隆进行 测序，DNA序列测定由大连宝生物工程有限公司完成.1.2.5RTPC

13、R产物半定量分析将PCR产物电泳条带用全自动图像分析系统 （德国KONTRON IBAS 2.0）分析，测出每一条带的面积（AREA）乘以平均光密度 （mean optical density of the object, OPTDM），得出结合光密度 （integrated optical density of the object, OPTDI）,根据 RAG 1 和 RAG2 与 Bactin OPTDI的比值计算目的基因的相对表达量来进行半定量分析.统计学处理：所得数据用xs表示，应用SPSS 10.0统计软件对数据进 行方差分析（Oneway ANOVA）和LSDt检验，P0.05为

14、差异有统计学意义.2结果2.1Jurkat细胞RAG1, RAG2 mRNA的表达在Jurkat细胞中同时检测到 RAG1 和 RAG2 mRNA 表达（图 1）.1: RAG1; 2: RAG2; M:核酸分子量标准 DL2000.图 1Jurkat 细胞 RAG1 和 RAG2 mRNA 表达2.2T细胞激活剂对Jurkat细胞RAGs mRNA表达的影响对照6, 12 h组 细胞RAG1, RAG2 mRNA表达量无显著性变化，而三种T细胞激活剂刺激诱导后 RAG1 mRNA表达量明显低于对照组（P0.05），以PMA+A23187组降低最为明显； 同一处理因素作用12 h组的细胞RAG

15、1 mRNA表达量都低于作用6 h组 （P0.05）； PHA作用组RAG2表达量均显著低于对照组（P0.05）, PMA+A23187 处理组未检测出RAG2 mRNA的表达；而抗CD3 mAb处理组中，作用12 h组RAG2 mRNA表达量明显高于对照组（P0.05，图2）.3讨论本实验发现，代表T细胞发育成熟阶段的Jurkat细胞同时表达RAG1和 RAG2 mRNA, RTPCR产物测序结果表明与Gene Bank报道序列完全一致.Jurkat细 胞经T细胞激活剂诱导后RAGs表达水平发生变化.结果提示Jurkat细胞有发生 TCR重排的可能，且其RAGs的表达可能经TCR信号传导通路

16、调节.进一步证实：已经具有功能性抗原受体的淋巴细胞也可表达RAGs，即在某些情形下TCR的存在 并不足以中止RAGs的表达.A: RAG1 与 Bactin; B: RAG2 与 Bactin. 1, 3, 5, 7:分别是 PHA,抗 CD3 mAb, PMA+A23187 和对照 6 h 组；2, 4, 6, 8:分别是相应各 12 h 组；M: 核酸分子量标准DL2000.图2不同处理因素对RAG1, RAG2 mRNA作用的RTPCR产物电泳图在体外用抗CD3抗体作用于小鼠胸腺皮质双阳性细胞引起TCRCD3复合体 交联，或用PMA和钙离子载体处理小鼠胸腺皮质细胞和未成熟preT细胞株

17、CCRFCEM后导致RAG1和RAG2表达下调，且PMA引起的RAGs表达下调作用更为迅 速而显著4-5.我们以PHA, PMA+A23187作用于成熟T细胞株Jurkat后RAGs 基因表达亦呈下调趋势，尤以PMA+A23187作用最为明显.但抗CD3 mAb作用组 Jurkat细胞RAG 1表达下调，而RAG2表达增加，与中枢或未成熟前T细胞株诱导 后的变化有所不同，可能反映了中枢T细胞和前T细胞与外周T细胞在RAGs表达 调节机制上的不同，有可能RAG2更多地参与了 Jurkat细胞TCRCD3复合体的信号 传导过程.RAGs的表达和调节是一个高度复杂而有序的过程，RAG蛋白的正确时空特

18、 异性表达对获得性免疫系统的正常发育至关重要.经典的免疫学理论认为，T细胞 迁出胸腺后不再表达RAGs和发生重排.但近年的研究表明，经重排形成的TCR在 特定条件下还可发生再次重排，使其原有的抗原特异性改变或发生亲和力的变化， 这种现象被称为受体编辑/修正6-8.外周T淋巴细胞RAGs的表达调节和 V(D) J重排机制与自身免疫病、肿瘤和免疫缺陷等疾病关系的研究已成为热点，国 外一些实验室主要利用转基因动物模型技术进行研究.基于本实验结果以及 Jurkat细胞是代表T细胞发育成熟阶段的单克隆细胞株的特点，我们考虑可利用 Jurkat细胞株建立一个研究外周成熟T淋巴细胞RAGs的表达调节和V(D

19、)J重排的 细胞模型，可弥补转基因动物模型研究成本和技术要求高等不足之处，便于我们在 现有实验条件下开展此方面的研究.【参考文献】1 Raul M, Frederick WA. Receptor revision in T cell: an open question J ? TRENDS Immunol, 2004, 25:276-279.2 Lantelme E, Mantovani S, Palermo B, et al. Increased frequency of RAGexpression, CD4+CD3low peripheral T lymphocytes in patien

20、ts with defective responses to DNA damage J . Eur J Immunol, 2000, 30:1520-1525.3 Lantelme E, Palermo B, Granziero L, et al. RAG gene expression and V(D)J recombination in CD4+CD3low mature T lymphocytes J . J Immunol, 2000, 164:3455-3459.4 Laurence A, Turka, Schatz DG, et al. Thymocyte expression o

21、f RAG1 and RAG2: Termination by T cell Receptor CrosslinkingJ. Science, 1991, 253:778-781.5 Geoffrey AM, Thomas J, Rakesh MG, et al. Expression of the V(D)J recombinase gene RAG1 is tightly regulated and involves both transcriptional and posttranscriptional controlsJ. Mol Immunol, 1992,29:1457-1466.

22、6 王小宁.受体编辑/修正免疫识别与耐受的新模式J.第二军医 大学学报，2002, 23(10):1071-1073.7 Cooper CJ, Orr MT, McMahan CJ, et al. T cell receptor revision does not solely target recent thymic emigrantsJ. J Immunol ,2003,171:226-333.8 Nagaoka H, Yu W, Nussenzweig MC . Regulation of RAG expression in developing lymphocytesJ. Curr Opin Immunol , 2000, 12:187-190.