酶的结构与性质检测技术的发展

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1、天津科技大学食品酶学研究生课程论文酶的结构与性质检测技术的发展Developmentof The strueture and properties of enzyme detection technolc摘要酶是生物体内重要的生物大分子之一，生物体的活动离不开酶。要想在分子水平 上解释生命现象离不开对酶结构和功能的研究。首先，本文介绍酶结构的基础,介绍了 目前酶结构测定的常用方法，包括实验测定（X-射线晶体衍射法和核磁共振波谱法）和理 论预测的方法，以及在酶结构测定上的最新研究进展。其次，本文对酶的性质进行介 绍，由于酶蛋白的酶学性质包含很多，包括其最适温度、最适PH、稳定性等。本文就 其性质

2、中的米氏常数和酶的活测定进行介绍，主要介绍了米氏常数的一些知识及酶活 的主要测定方法。关键词：酶，结构，X-射线衍射，核磁共振，结构预测，酶学性质，米氏常数Km），酶 活测定AbstractEnzyme, as one of the most two important bio-molecules, is the carrier of almost All the activities of organisms. Researches of structural and functional information illuminate the life phenomena on the mo

3、lecular level. Firstly, we gave a brief introduction to enzyme structure and commonly used structure exterminating methods including experimental Determination (X-ray diffraction and nuclear magnetic resonance spectroscopy) and theoretical prediction methods, and the latest research progress ofenzym

4、e structure. Then, this paper introduces the nature of the enzyme, because of enzyme include many properties, including its optimum temperature, optimum PH, stability, etc. This paper discuss the nature of the michaelis constant and activity determination, especially the knowledge of the enzyme acti

5、vity and the main measurement method.Key Word：enzyme, structure, characterization, michaelis constant(Km, enzyme activity目录1 前言 12 酶的简介 22.1 酶的定义 22.2 酶的发现 22.3 酶的生物学功能 23.酶的结构研究 43.1 酶的结构简介 43.2 酶结构的主要检测方法 43.2.1 酶结构的实验测定方法 43.2.1.1 射线衍射法 43.2.1.2 核磁共振光谱法 43.2.2 酶结构的理论预测方法 53.3 蛋白质结构检测新技术最新进展 63.3.

6、1 X射线无电子激光器（XFELs）63.3.2单个体蛋白电子断层成像技术（IPET）74.酶的性质 84.1 酶动力学研究84.2 酶活的测定94.2.1比色法 94.2.1.1 还原糖法94.2.1.2 色原底物法94.2.2黏度法 94.2.3 免疫学法 94.2.4 琼脂板扩散法 104.2.5 比浊法 104.2.6 近红外光谱法 104.2.7 高效液相色谱测定法 114.2.8 体外模拟消化技术 115.展望 12参考文献 131 前言酶是生物体内重要的生物大分子之一,是生物体几乎所有活动的承担者,如生化反 应的催化酶,呼吸系统中的血红蛋白,免疫系统中的抗体等等。生物体几乎所有的

7、活动都 离不开酶，要想在分子水平上解释生命现象离不开对酶结构和功能的研究。多数酶在 生理条件下都会折叠成稳定的三维空间结构,酶的生物学功能在很大程度上取决于其空 间结构,其结构构象多样性导致了不同的生物学功能，所以酶结构与性质的研究也因此 越来越得到重视。同时酶结构测定实验是非常费时费力,消耗资源也大,而且成功率有限 为了解决这个矛盾,一方面国际上开展了许多结构基因组计划,试图通过高通量测定酶 结构在基因组规模上全面理解酶的功能,同时加快结构测定实验的速度,降低单个结构 测定的成本。另一方面研究人员一直试图发展计算机模拟的方法来进行蛋白质结构预 测,虽然在这方面取得了很大的成绩,但要实现完全解

8、决酶结构预测的目标还需很多的 努力。同时由于不同的酶是不同的微生物通过发酵过程产生的，酶产品的酶学性质差 别较大。并且各种微生物所分泌的酶的最佳pH值、温度和对底物的亲和性都不相同， 酶制剂目前都还没有一个统一的定义及检测标准。故本论文的重点主要是两方面:一是 酶结构的测定方法及其发展，二是酶学性质（主要是米氏常数和酶活）检测技术的发 展。2 酶的简介2.1 酶的定义酶（Enzyme ）又称酵素，指具有生物催化功能的高分子物质。虽然酶大多是蛋 白质，但少数具有生物催化功能的分子并非为蛋白质，有一些被称为核酶的RNA分子 和一些DNA分子同样具有催化功能。此外，通过人工合成所谓人工酶也具有与酶

9、类似的催化活性M 。有人认为酶应定义为具有催化功能的生物大分子，即生物催化剂， 则该定义中酶包含具有催化功能的蛋白质和核酶。2.2酶的发现酶的发现来源 于人们对发酵机理的逐渐了解。早在18世纪末和19世纪初人 们就认识到食物在胃中被消化，用植物的提取 液可以将淀粉转化为糖。但对于其 对应的机理则 并不了解。至19世纪中叶，法国科学家路易巴斯德对蔗糖 转化 为酒精的发酵过程进行了研究，认为在酵母细胞中存在一种活力物 质，命名为“酵 素”（ferment）。他提出发酵是这 种活力物质催化的结果，并认为活力物质只存 在于生命体中，细胞破裂就会失去发酵作用。1878年，德国生理学 家威廉屈内 首次提出

10、了酶（enzyme）这一概念。随后，酶被用于专指胃蛋白酶等一类非活体 物质，而酵素（ferment ）则被用于指由活体细胞产生的催化活 性。这种对酶的错 误认识很快得到纠正。1897年，德国科学家爱德华比希纳开始对不含细胞的酵 母提取液进行发酵研究，通过在柏林洪堡大学所做的一系列实验最终证明发酵过 程并不需要完整的活细胞存在他将其中能够发挥发酵作用的酶命名为发酵酶（zymase ）。这一贡献打开了通向现代酶学与现 代生物化学的大门，其本人也因 发现无细胞发酵及相应的 生化研究而获得了 1907年的诺贝尔化学奖。2.3酶的生物学功能在生物体内，酶发挥着非常广泛的功能。信号转导和细胞活动的调控都离

11、不 开酶，特别是激酶和磷酸 酶的参与7。酶也能产生运动，通过催化肌球蛋白上ATP 的水解产生肌肉收缩，并且能够作为细胞骨架的一部分参与运送胞内物质8。一 些位于细胞膜上的ATP酶作为离子泵参与主动运输。一些生物体中比较奇特的功 能也有酶的参与，例如荧光素酶可以为萤火虫 发光吻。病毒中也含有酶，或 参与 侵染细胞（如HIV整合酶和逆转录酶），或 参与病毒颗粒从宿主细胞的释放（如 流感病毒的神经氨酸酶）。酶的一个非常重要的功能是参与在动物消化系统的工作。以淀粉酶和蛋白酶 为代表的一些酶可以将进入消化道的大分子（淀粉和蛋白质）降解为小分子，以 便于肠道吸收。淀粉不能被肠道直接吸收，而酶可以将淀粉水解

12、为麦芽糖或更进 一步水解为葡萄糖等肠道可以吸收的小分子。 不同的酶分解不同的食物底物。在 草食性反刍动物的消化系统中存在一些可以产生纤维素酶的细菌，纤维素酶可以 分解植物细胞 壁中的纤维素，从而提供可被吸 收的养料。在代谢途径中，多个酶以特定的顺序发挥功能： 前一个酶的产物是后一个酶一个酶。有些情况下，不同的酶可 复杂的调控：比如一个酶可以以较 诱导后可以较高的 活性进行催化。 而一旦没有酶的存在，代谢既不能 成以满足细胞的需要。实际上如果的底物；每个酶 催化反应后，产物被传递到另 以平行地催化同一个反应，从而允许进行更为 低的活性持续地催化该反应，而另一个酶在被 酶的存在确定了整个代谢按正确

13、的途径进行； 按所需步骤进行，也无法以足够的速度完成合没有酶，代谢途径，如糖酵解，无法独 立进行。例如，葡萄糖可以直接与 ATP反应使得其一个或多个碳原子被磷酸化；在没有酶的催化时，这个反应进行得非常 缓慢以致可以忽略；而一旦加入己糖激酶， 在6位上的碳原子的磷酸化反应获得 极大加速，虽然其他碳原子的磷酸化反应也在缓慢进行，但在一段时间后检测可以发现，绝大多数产物为葡萄糖-6-磷酸。于是每个细胞就可以通过这样一套功能性酶来完成代谢途径的整个反应网络。3. 酶的结构研究3.1 酶的结构简介从1834年德国博物学家施旺 第一次分离出胃蛋白酶开始，人 类对酶的结构 与功能的研究就一直没有停下脚步。通

14、过对结 构的研究，人们也在一步步揭示酶 的秘密。时至今日，人们甚至已经可以制作出一些人工酶，到底酶的结构是什么？ 由于绝大多数酶是蛋白质，只有少数是核酸 RNA （核酶），所以关于酶结构的研 究，主要还是 对蛋白酶的研究。这里介绍的， 也主要是蛋白酶的结构。酶由一条或多条由氨基酸首尾以肽键连接形成的共价肽链构成，组成酶的氨 基酸有 20 种,但是不同的酶的氨基 酸组成和排列顺序不同 ,加上多肽链在空间形成 不同的折叠，导致其结构和功能的 多样性,线性多肽链在空间折叠成特定的三维空 间结构，称为蛋 白质的空间结构或构象，多肽链 共价主链的氨基酸顺序称为蛋白 质的一级结构。多 肽链借助氢键排列成沿

15、一维方 向具有周期性结构的构象称为二 级结构，如a-螺旋和卩-折叠、卩-拐角、无规则卷曲。酶的活性中心往往是若干个在 一级结构上相距很远，但在空间结构上彼此靠近的氨基酸残基集中在一起形成具有一 定空间结构的区域，该区域与底物相结合并将底物转化为产物，对于结合酶来说，辅 酶或辅基往往是活性中心的组成成分。而多肽链借助各种次级键 （非共价键）盘绕成 具有特定肽链 走向的紧密球状构象称为蛋白质 的三级结构。三级结构除了包 含 a- 螺旋和卜折叠这样的规则二级结构之外，也包含无规则的松散肽链片段。具有三级 结构的肤链间 形成特定的空间关系称为蛋白质 的四级结构。一般认为,蛋白质的一 级结构决定二 级结

16、构，二级结构决定三级结构， 蛋白质的生物学功能在很大程度上 取决于其空间 结构，蛋白质结构构象多样性导致了不同的生物 学功能。与很多人造 聚合物不同 ，蛋白质在生理条 件下通常折叠形成稳定的三维空 间结构，蛋白质形成 的天然三维空 间结构与其生物学功能是对应的 ，只有处于它自 己特定的三维空间 结构情况下 ，才能获得它特定 的生物活性 10。3.2 酶结构的主要检测方法3.2.1酶结构的实验测定方法一般而言，对于酶结 构的测定，主要的科研方法包 括X光衍射法、核磁共振 谱法，以及传统的单颗粒电镜重构等。3.2.1.1 X-射线衍射法（X-ray diffraction method ）X-射线

17、衍射法是最 早也是目前最有效的蛋白质结 构测定方法。通过X-射线衍 射法可间接地研究蛋白质晶体的空间结构。对晶体结构的研究将帮助人们从原子 的水平上了解物质。由于蛋白质可以结 晶，通过X射线晶体学就可以对酶的三维 结构进行研究。第一个获得结构解析的酶分子是溶菌酶，溶菌 酶结构由大卫菲利浦（David Phillips ）所领导的研究组解析，并于1985年发表11。这一成果的发表标志着结 构生物学研究的开始，高分辨率的酶三维结构使得对于酶在分子水平上的工作机 制的了解成为可能。从此很多科学家应用此方法研究不同 酶的结构，其中Michael P、Robertson and William G.Sc

18、ott利用X射线衍射技术确定了核酶的晶体 结构12o 英国科学家用X射线衍射技术破解了艾滋病病毒整合酶的三 维结构，这一结果有 助于研究更有效的艾滋病治疗药物13。X射线衍射法，能提供高分辨率的结构模型，同时蛋 白质数据库（PDB）中超过 80%的结构是由这种 方法测定的。但是X射线晶体学的缺点包括蛋白质晶体的形 成和培养没有 普遍适用的规律，晶体结构测定 的周期较长，有些蛋白质很难形成 结晶等缺点，同时X射线衍射法测定的是非生理条件 下的一个静态晶体结构，所 得到的晶体往往是分子处于基态或不同构象的平均，而分子行使功能时多发生在 激发态、过渡态X射线晶体技术很难捕捉到分 子的动态信息，使X射

19、线衍射法在 酶结构研究中的应用受到限制14。321.2核磁共振谱法（NMR ）多维核磁共振作为测定生物大分子，特别是蛋白质溶液三维结构最重要的手段， 近年来取得了飞速的发展。1997年10月Nature结构生物学分册的增刊全面综述了 NMR 用于生物大分子研究的最新进展15。相对于X-射线晶体衍射技术，过去认为核磁共振 只适合研究分子量较小的蛋白质的结构，近年来由于核磁共振波谱技术以及标记方法 的发展，核磁共振方法可以测定的蛋白质的分子量，从原理上将不受限制。目前可以 测量4050kD分子量的蛋白质.而且这个限制正被突破，用核磁共振波谱方法测定结 构的最大的单链蛋白质的分子量已达到82kD16

20、。至今，核磁共振波谱技术是能够在原 子分辨率下测定溶液中生物大分子三维结构的一种方法。3.2.2酶结构的理论预测方法与实验测定酶结构相比，理论预测的方法具有快速、低成本、高通量的优点，理论预测酶三维结构的方法大致可以分为两类：一类是基于知识的建模预测(knowledge-based Prediction)，即利用己有的酶结 构数据根据模式匹配的原则在蛋 白质序列的基础上进行预测和优化；另一类是基 于物理模型进行模拟的从头计算 预测(physical-based Prediction)，即基于一定的物理模型和参数运动计算机模拟的 方法将酶从伸 展的去折叠的没有功能的结构(de natured S

21、tructure extended Structure)折叠成有天然的具有生物学功能的 结构的过程17。这两类预测方法各有优缺点，第一类方法相对比较简单，速度较快，但是需 要找到己有结构的具有相当序列同源性的酶作为模板；第二类方法运用分子物理 和分子化学的首要原则直接从一级结构预测三级结构，因此需要进行大量的计算 资源。在实际预 测酶结构的过程中，通常将两种 方法配合使用，以突破各自的局 限性。目前，酶结构预测的方法有3种，其中比较建模(eomparativemodeling)和折叠 识别法(foldrecognition)是根据与己知结构模板的 序列相似性分类的2种基于知识 的建模预测方 法

22、，而从头计算法(ab initio Prediction)是基于物理模型进行模拟的 蛋白质结构预测方法。比较建模是一种基于知识的蛋白质结构预测方 法。如果己知与目标酶具有足 够同源性的蛋白质结构(模板)的情况下，比较建模方法 可以快读的推测出其中保 守的结构骨架，因为在进化过程中，三维结构比序列要保守的多，变化要缓慢的多。 折叠识别法当目标蛋白和模板的序列相似性超 过30%但是不到50%时，就需要改 进序列比对方法,如多序列比对(multi-Sequenee alignment)或采用折叠识别的方法。 从头计算法当已知结构的蛋白与目标蛋白的序 列同源性低于30%(twilight Zone)，

23、 基于序列的预测方法基本无法得到可靠的结果，这时从头计算法就成为唯一选择 从头计算法是基于物理学原理，直接从蛋白质的氨基酸序列。这种方法除了能得 到预测结构之外还可用于研究蛋白质的折叠过 程，而且不需要知道蛋白质功能等 附加信息，理论上来说从头计算法是最准确最可靠最理想的预测方法。3.3蛋白质结构检测新技术最新进展331 X射线无电子激光器(XFELs)今年年初，美国科学家制造出了世界上波长最短、单色纯度的第一束原子X射线 激光,科学家们首次通过一种超强X射线激光，揭示了一种蛋白前所未有的原子结构， 从而证明了一种突破性蛋白结晶技术的可行性。这种强大的X射线激光能用于多个方 面，此番德国的科学

24、家们就将其用在了蛋白结晶技术上确定了一种关键酶的结构18。 这种酶对于单细胞寄生虫布氏锥虫(Trypanosoma brucei)存活至关重要，而后者正是 非洲昏睡病的罪魁祸首。虽然这种X射线无电子激光器(x-ray free-electron lasers， XFELs)能在同步加速器上研究的最小结晶结构，研究人员能收集到无损数据，但是它 自此就能取代了传统的以X射线源作为同步加速器，获得数以万计蛋白质结构的方法 的说法，还为时尚早19。3.3.2单个体蛋白电子断层成像技术( IPET)近日，美国劳伦斯伯克利国家实验室(Lawrence Berkeley National Lab)任罡博士

25、和张磊博士发表了一篇最新发表的关于测定单个蛋白分子三维空间结构方法的论文。 他们分别测定了人体抗体蛋白以及高密度脂蛋白的单个分子的三维密度图，并取得了 迄今为止最高分辨率的单个蛋白分子的三维结构。Zh-jna L, and Hn J PI oS (ZE* 7(1)：町帅别任罡和张磊博士发展了一套测定任意单个蛋白质个体分子的三维结构方法，称之 为Individual-Particle Electron Tomography (单个体蛋白电子断层成像技术，即I PET)。 这是一种利用电子显微断层成像技术有机地结合独立开发的三维结构重构算法研究蛋 白质个体分子结构的技术20。该研究成果被多名专家评

26、价为具有开拓性的方法论，而 论文的发表对蛋白个体分子的三维结构测定和蛋白质动态结构的研究具有里程碑式的 意义。4. 酶的性质量都不会发生改变，酶的作用条件 性，活性可调节性 有些酶的催化 会被咼温、酸、强碱等破坏。下面 酶活。酶的性质有很多种，包括酶具有高效率的催化 能力；酶具有专一性；酶在生 物体内参与每一次反应后，它本身的性质和数 较温和等。酶对化学反应的催化效率称为酶活 性与辅因子易变性，大多数酶是蛋白质，因而 针对酶的性质，主要介绍它的动力学性质及其4.1 酶动力学研究1902年，维克多亨利提出了酶动力学的定量理论21；随后该理论得到他人证实并 扩展为米氏方程22。酶可以在一秒钟内催化

27、数百万个反应。例如，乳清酸核苷5-磷酸 脱羧酶所催化的反应在无酶情况下，需要七千八百万年才能将一半的底物转化为产物； 而同样的反应过程，如果加入这种脱羧酶，则需要的时间只有25毫秒23。酶催化速率 依赖于反应条件和底物浓度。要达到一定反应速率所需的底物浓度也是一个重要的动力学指标。这一动力学指 标即米氏常数（Km），指的是达到Vmax值一半的反应速率所需的底物浓度。对于特定 mmax的底物，每一种酶都有其特征Km值，表示底物与酶之间的结合强度（Km值越低，结 合越牢固，亲和力越高）。米氏方程是基于质量作用定律而确立的，而该定律则基于自由扩散和热动力学驱 动的碰撞这些假定。然而，由于酶/底物/产

28、物的高浓度和相分离或者一维/二维分子运 动，许多生化或细胞进程明显偏离质量作用定律的假定24。在这些情况下，可以应用 分形米氏方程25262728。存在一些酶，它们的催化产物动力学速率甚至高于分子扩散速率，这种现象无法 用目前公认的理论来解释。有多种理论模型被提出来解释这类现象。其中，部分情况 可以用酶对底物的附加效应来解释，即一些酶被认为可以通过双偶极电场来捕捉底物 以及将底物以正确方位摆放到催化活性位点。另一种理论模型引入了基于量子理论的 穿隧效应，即质子或电子可以穿过激活能垒（就如同穿过隧道一般），但关于穿隧效 应还有较多争议2930。有报道发现色胺中质子存在量子穿隧效应31。因此，有研

29、究者 相信在酶催化中也存在着穿隧效应，可以直接穿过反应能垒，而不是像传统理论模型 的方式通过降低能垒达到催化效果。有相关的实验报道提出在一种醇脱氢酶的催化反 应中存在穿隧效应国，但穿隧效应是否在酶催化反应中普遍存在并未有定论国。4.2 酶活的测定通常酶制剂活性的检测是采用实验室分析手段来进行评价，其操作相对简单，检 测所用时间短，便于生产实践应用。酶活测定结果虽不能完全反映酶的使用效果，但 通过检测至少可以避免使用劣质的酶制剂。我国工业标准中已经确立了植酸酶（GB/T18634）、纤维素酶（NY/T912）、（3-葡聚糖酶（NY/T911）的测定方法。另外， 为了生产研究的需要也制定了很多用于

30、酶活力的测定方法。目前测定酶制剂活性的方 法主要有以下几种方法。4.21比色法比色法是以反应生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶 液颜色深度来确定待测组分含量的方法。1997年孙淑琴、邵冬梅介绍了比色法测定糖 化酶活力新方法并计算出糖化酶的活力34。比色法简单、快速、准确度和标准法相当， 是仪器分析测定糖化酶活力的理想方法。根据原理不同可分为还原糖法和色原底物法4.2.1.1还原糖法这种方法是通过酶作用于化学合成或从自然界提取出来的底物来进行测定的。非 淀粉多糖酶与底物在特定的条件下反应，反应产物为还原糖，在与显色剂反应后，通 过比色确定还原糖的生成量，同时制作标准曲线。酶

31、的活性表示为单位时间产生一定 浓度的产物所需要的酶量。该法可适用于大部分酶活力的测定，如淀粉酶、蛋白酶、 脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、3-葡聚糖酶、纤维素酶等的测定。根据显色剂 的不同又可分为DNS法、钒钼酸铵法和地衣酚法。其中DNS法由于操作简单、显色 稳定，是目前众多实验室和企业在测定非淀粉多糖酶时应用最多的测定方法。4.2.1.2 色原底物法原理是利用人工合成的含色原基团的底物在酶的作用下释放出有色物质，利用分 光光度计比色测定有色物质的含量计算酶活。如Wirth等曾利用此方法测定几丁质酶、 溶菌酶、木聚糖酶、纤维素酶和1,3-B-葡聚糖酶等多糖水解酶的活力35。该法操作简 单、重

32、现性好，但酶作用于合成底物与天然底物的效果有一定区别，用合成底物测定 的酶活并不能代表酶制剂在应用于天然饲料时所能发挥的酶活大小。4.2.2 黏度法这种方法是根据酶能够降低一定浓度的标准底物（控制pH值、温度等条件）的黏 度的能力来确定酶的活性。利用的底物主要有化学合成的底物（如CMC用于纤维素酶 的测定）和自然提取的底物（如小麦阿拉伯木聚糖用于木聚糖酶的测定）。测定的酶 的活性值是通过与同时测定的标准酶活性的比较，来确定酶的活性。该法可用于木聚 糖酶、P-甘露聚糖酶、P-葡聚糖酶等酶活测定。这种方法的特点是通过降低底物的粘度 来反映酶的活性，这也正是酶在体内起作用的重要特征。该法虽然灵敏度较

33、高，但重 现性差，操作复杂费时，应用难于普及。4.2.3免疫学法用于酶活性分析的免疫学法包括ELISA法和免疫凝胶扩散法。这两种方法是根据 酶与抗体之间发生反应，然后ELISA法通过第二步反应，凝胶扩散法则通过印染过程 来确定酶的活性。Zahradnik等将酶联免疫吸附法用于检测了黑曲霉、大豆、小麦、大 米饲料等11种样品中的植酸酶活性检测，灵敏度均达到40pg/mlPI批间变异系数 V10%36。这些方法非常灵敏，能够检测到极低水平的酶蛋白。但它们的缺点是对于每 个产品的酶需要特殊的抗体，另外抗体能够与非酶蛋白质发生反应。由于抗体本身所 用的蛋白质是特定的，因此，由不同生产者生产的同种类型的

34、酶之间是没有交叉性的。 另外，采用实验动物的敏感性也值得探讨。4.2.4琼脂板扩散法Bae等在1999年建立并优化了琼脂平板法测定了微生物产植酸酶活性的方法基于 该方法 筛选了动物瘤胃内容物中产植酸酶厌氧细菌。将酶作用的底物与琼脂混合熔融 后，倒入培养皿中或载玻片上制成琼脂平板。用打孔器在琼脂平面上打出一个半径 45mm的小孔，加入酶样培养一定时间后，用染色剂显色或用展开剂展开显示水解区，利 用水解直径与酶活力关系测定酶活力37。史锋等38利用此方法测定了纤维素酶和B-葡 聚糖酶的活力。Ten等39还将此方法用于饲料中微量木聚糖酶活性的测定。由于检测 过程中不受饲料本身含有的还原糖的干扰，因此

35、可有效弥补常用方法DNS显色法检测 饲料中木聚糖酶存在的不足。4.2.5比浊法比浊法是溶菌酶活力测定中常见的方法，以溶壁微球菌为底物，根据溶菌酶破坏细 菌细胞壁，从而降低细菌悬浮液浊度的原理，用分光光度法测定40。此方法常以酵母或酵 母细胞壁在缓冲溶液中的浊度或吸光度的降低来表示酶活力，如卩-葡聚糖酶活力的测 定41。4.2.6近红外光谱法近红外光谱是可见光与红外光谱之间的一段谱区，其波长范围为7502500 nm近 红外光谱分析是指利用近红外光谱区包含的物质信息，主要用于有机物质定性和定量 分析的一种分析技术具有对样品无破坏性操作简便分析迅速测量信号可以远距离传输 和分析等特点，Smith等

36、利用近红外光谱技术建立了鸡粪便中植酸磷的定量分析模型， 对其进行了快速定量分析。杨海锋等通过广谱分析建立了校正模型。Selle认为近红外 光谱技术快速检测植酸酶酶活含量可行和认为对近红外光谱在植酸酶活性分析中应用 非常有前景42。4.2.7高效液相色谱测定法Berry等人工合成了一个新的发色底物植酸的类似物（TInsP5）以TInsP5作为探 针建立一种快速高效的测定土壤中植酸酶的酶活性的反相高效液相色谱（RP-HPLC ）紫 外（UC）检测方法。该方法快速稳定灵敏度高适合体外植酸酶活性的评价研究阴。4.2.8体外模拟消化技术酶活测定毕竟不能反映外源酶在机体内真实的作用效果，因此，对于体外法评

37、定 饲料营养价值的研究不断增加。体外法评定营养价值是通过模拟消化道内温度、pH、 消化酶分泌、胃肠运动和养分吸收等参数，在体外建立一套与消化道内环境接近的操 作程序，对酶进行营养价值预测和评定。常用的体外模拟消化技术包括：胃蛋白酶 胰酶法；胃蛋白酶一小肠液法；胃蛋白酶一胰酶一瘤胃液法；胃蛋白酶一胰 酶一碳水化合物酶法。5. 展望在酶结构测定方面，研究人员一直试图发展各种方法来进行蛋白 质结构预测, 最新技术虽然具有开拓性的方法论，并且对蛋白个体分子的三维结构测定和蛋白质动 态结构的研究具有里程碑式的意义。但是离得数以万计蛋白质结构仍然相去甚远。虽 然在这方面取得了很大的成绩，但要实现完全解决酶

38、结构测定的目标还需很多的 努力。不同的酶是不同的微生物通过发酵过程产生的，酶产品的酶学性质差别较大。并 且各种微生物所分泌的酶的最佳pH值、温度和对底物的亲和性都不相同。而目前，除 植酸酶、纤维素酶、木聚糖酶和0葡聚糖酶有正式颁布的国标或行标酶活测定方法外， 其他酶制剂目前都还没有一个统一的定义及检测标准。因此，厂家在比较不同厂家的 酶制剂时，在没有统一的测定方法情况下，应首先确定自己认可的检测方法，然后在 完全相同的测定条件进行检测，这样得出的结论才具有可比性。参考文献1 Smith A.D. etal. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molec

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