胶原蛋白含量的测定和杂蛋白的测定

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1、胶原蛋白的鉴別及其杂蛋白检测技术付步芳*，陈丹丹(中国药皿生物创品检垃所，北京100050)捕要H的:E立用田S麻丙烯酰胺族胶电湫法(S)S- PAGK來鉴别胶原蛋白及分析杂蛋白含显的方法。方法:利用特异 性的胶原荀对狡以至口逬行騎解!fn后检测样乩中没有枝胶原55酒解的亲贾口的介虽，同时检测实鉴方法的染色灵墩度确 疋杂蛋口的检测卜限 納戾:经过多次验证实城农明心木实址条件卜，考马飓亮蓝对B企的染色极限能达到100啤含启在 ()5保以上的杂蛋口均能祓测定结论:木研究建电了冇效的杂茨白恰则技术，为胶原蛋白为基础的生物话料中杂蛋口的检测 和船控m nrnJV的方法。対8诃嘶歩白；杂萤白；as. V

2、GE中用分类号：R9I7文斌标识码：A文 1ft!lX2S4 - 1793(21)10)03 1351 -0SCollagai rientf cation and de tec tug method of m purity pro tenFU Bu - King CH阪 Diin (Un(Natrnal nwioKC t)r 饥 Conoolar Hhanwcurical and Biohgicai Hnducu. ttcijtiz 100(ex). ChtnOAbstract O bjectFO： h tins paper collagen wos identified, and inpur

3、ity piotein contained in collagen was ala)dc tiimined by JDS - RGE Methods:The collagen sonplc a)newcx compaicd r those of standard collagen Re- suJts:By using co Ihgcnax digcslbn which ipcxifically hydiulyzc collagen, wc ilcicc led die con tn ts of hi purity piu- 匕in which was not been hjdn)lv7cd b

4、y collagvna?e and the dyeing senand (he burr lirniiwas hten decided These nsoilt shrued that the dyeing Irnii of awQMie blue we, 100 ng, and the tnpurii pmtem with motv than (I 5% content could be detected Conciasbn: h this study,we established exaninaibn method of mpuritvpnteii) incollagen - baed b

5、ktnaierials胶原蛋白(Colhgen)广泛存在丁动物细胞，定 细胞外基然最虫耍的组成成分也泉动物结缔组织 中最主要的 种结构性蛋口质为生物科技产业最 具关键性的反林料之，其应用领域包拈伍材料、 化妆詁、借詁丄业、研究用途等。胶必蛋口是类蛋口质家族.现已至尘发现了 30余种胶原贵口琏的编码基冈。可以形成16种以 上的胶底贡白分子。根折它们在坏内的分布和功能 特点.0前将胶必分成间质胶加、基底腹胶顶和细胞 外战胶原，问质型胶原蛋口分了占整个机体胶反的 绝大部分。包描n分子.I盘胶必蛋口址在动物休中发现的种绪构蛋口，是胶腹 纤维组分中的部分它来源于农达在胶顶黃口 锭的COL1A1和COL1

6、A2基I刀。所有的胶廉资白 均具有山三条聚狀链单冗组成的三嫖旋结构狡原 蛋口富禽甘氨唆丄刃冠酸丄肺氨峻和4 轻肺 氨酸，倉少呈的硫且不倉L 色氨酸.羟脯氨酸是 种胶原黃口特有的氮基駿约占胶原蛋白的 9%13%。杂茶白泉指在胶氐蛋口纯化过程中残 留的除I型胶療蛋口外的其它蛋口质&对丁胶爆蛋口的鉴别及其杂蛋口检测，3前 尚无标准方法。本文采用QS 聚丙烯哦胺薇胶 电泳法(SD j PAGE)来鉴别胶岐蛋口及分析杂蛋 口金呈 JDSPAGE消除了不同蛋口质分了的吐 荷效应便董白质按照分子買大小分离谧过与 胶廉蛋白标准詁的电泳条帝进行比较来鉴别狡脈 蛋口：利用特异性的胶廉酶对胶原资口进行萌 解而后榆測

7、样甜中没有被胶瓯酶消解的杂贺4 的儈呈，同时检测实验方法的染色乂姒度，桅定杂 蛋白的检测下很.1材料和方法11仪器与试剂111仪器(1庆半(2) 电沐仪(3膨像分析系统1 L 2试剂胶原酶(2)Tri :纯度95o(幻无水氯化钙:分祈纯含虽93%。：水合璘酸 奁的:分析纯，含呈99.0%o (G1M烯妊胺(恥巧1别泌朋“):浓度40%.(7谀酚兰:纯度洌8%。(8)甘氮酸:金昼N99%-(9烤马斯売蓝染色液(10)牛血淸白蛋白(BSX)o)分了昂麻准品:分子呈范禺30301) kDao(12) 魁胶原蛋白标谁品(13) 乙酿:分析纯含買左995%。(14) 过硫醸钱(APS):纯度298仏(四

8、甲基乙胺(TB4ED):纯度98. 0%.(氢氧化钠:分析纯，含量296.0%.甘油： 纯度99%oL2测定步骤L 2 1样詁处埋(1)0.005 mg mL 1 BSK0E制：a) l(X)uL2wg mL B弘标准液，加入 100UL 超纯水混合，得到1 mg nif1 B*稀秆液。b) 取1 mg niL*1 B处稀释液100 UL加入900UGB纯水混合，紂理 0.1 mg mL 1液=c) 取 0.1 mg njL B5A稀释液 1(T) UL加入 900 U阖純水混合，得到0 01 mg ml/ 1 B5A稱释液M 0.01 mg mT/1 B5A稀释液 im UL加入 100 U

9、U品缓冲液(2X)置于10090C热水中 12m睹取出得到0.(X6mg mL 1的B从样詁液(2孵品A阪氐样品)处坦：取0.5 g(比重相当于1)胶原蛋白(6 mg mL1) 和1 mL之0. 1%乙駿丁 2mL离心管中质荡混仏此 时胶凍黃口浓度为2 mg niL 収10DUL濬解液 与100 UL样詁缓冲液于玻璃试管中滇合，此时胶原 蛋口浓度为1 mg果颜色变成徴黄色时力I 入P-2PL 1NNG【把颜色调成蓝色以确定系统中 的pH),餐于10090匸热水中I2 m碍取出.(3) 样品B鮫原样胡吓胶療酶)处理：収05目版瓯蛋口并加入ImL胶如酶消化液蛍 T 15 inL试管中.T 37 C

10、水浴锅作州4 h(lll：时应无 肉眼可见的残留物)，比吋扣除添m胶廉竭所禽萤 口质會虽后样甜浓度为2 mg niL 取100UL 述样品9 100 L样梟煖冲液于小枝璃试管中混合， 此时扣陰所添加胶原酶G的样品浓度为 1 mg mL1 于10090 *C热水中12 min后 取出。(4) 样品C鮫原酶消化液滋理：取0.5mLS纯水力I入I tnL胶原IW消化液混 合，収100 PL述样M与100儿样晶缓冲液于玻 璃试管中混合，置干1()0-01) 水中12 min后 取出。胶煩标准甜处埋：称取0. 005 g起胶原标准品置丁 15 mL离心 管中期入5mL 3%乙腹,振荡溶解胶掠蛋口，此时

11、胶原蛋白浓度为1 n电niL 取100AL溶解液与 100 UL样晶缓冲液于小玻璃试管中混合此时狡总 萤口浓度为1 mg讥(如果规色变成徽改色IN. 加入12PL 1 NN4H把颇色调成蓝色，以确定系 统屮pH) 置于10090 C热水屮12 min启取出.L 3考马斯亮蓝对R也染色极限分析制备7%分离胶(Sepatutbn Gel)和4%浓缔胶 (Stacking Gel)，分别取 0.05 mg mL 1 BS样品液 10 “L 0.005 mg mL 1 BSA样詁液 20,10,8,6, 4Pl4t 6份样甜分别添加到6个加样孔中，B弘的 净值分别为500,10)0,40,30,20咚

12、并在后1个加墜1 B从梁色敬限Fig 1 TTicchciiig linitofBSA样孔中添加分了呈标准.电泳电压为110Y。用 影像分析系境对脱色后的胶片进行分祈，结果见 图H14胶原彊白鉴别及杂寮白分析制备7%分离胶（Scpaiaiion CJcl和4%浓缩 胶（Stacking Gel）,分别取分子虽标准品10 UL. 0.05 mg mL 1 B5AI0ML （500 ng）、0005mg niL1 BSA 20吒（100 ng）、样胡A （胶瓯样胡） 10UL、样姑B （胶原样品十胶原葩消化液） 】0山八样胡（】阪原晦消化裁）10UL、股原蛋口 标准品20PL共7份样詁分别添加到7

13、个加样 孔中。电泳电压为HO Vo用影像分析系统对脱 色后的投片进行分析，結果见图2-klRrkerl 2:胶阪样帛 3:4: KJ5tTt?i *6; 9i 6:BSA 25$ 7:BS4 SOOr 8:lUrkcr2明2杂冬白分析Fij 2 Analyv? of inpurity piotem2结果和讨论2 1胶凍蚩口鉴别胶取第白山泳条带与 他胶原资白麻准品进行 比较其电泳条带应-致口22杂至口分析22 1将脱色后的胶片在影像分析系统中进行扫 描计算分子SAT loo MM以匕的条带密度样詛 A结杲为A样品B结果为B样詁C结果为C,各 密度以叹示&212杂飯白含虽计算a）当B - C=0时样品中胶原蛋口纯度（%）= （10000 - BSA极限净值）710000 X100%b）肖B CH0吋，样品中胶原蛋口纯度（掘） A - （B - C）c）样品中杂蛋口含虽（%） =100% 胶氐蛋口 纯度（%）3小结经过多次验讦实验表明在本实验条件下石耳 斯亮蓝对BSX的染色极隈能达到100咄、介虽在 05%以上的杂蛋口均能被测定，利用胶脈蛋口特 有的特征条带，通过5标准胡比対来鉴别是比校简 单可掘的力法参占文献I 5F 中国药典.2（M）a vol muso：网求IVC2柬国栋.朵新分子生物学实悄技术.北京：科宁出版礼,第一版，RB,20（本文于2010年2月）日修改回）