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1、肠上皮细胞培养技术肠上皮细胞培养技术报告人：欧阳万金报告人：欧阳万金肠上皮细胞肠上皮细胞 肠上皮细胞（肠上皮细胞（intestinal epithelial intestinal epithelial cells,IECScells,IECS）是具有极性的柱状上皮细胞，参与）是具有极性的柱状上皮细胞，参与肠道的消化、吸收、分泌、免疫屏障和应激反应肠道的消化、吸收、分泌、免疫屏障和应激反应等，黏膜上皮内含有大量的免疫细胞和免疫分子，等，黏膜上皮内含有大量的免疫细胞和免疫分子，是机体内最大的免疫组织。是机体内最大的免疫组织。IECIEC是体内更新最快的一类细胞，对维持肠上皮的是体内更新最快的一类细
2、胞，对维持肠上皮的功能有重要作用。其快速更新的特性，使其成为功能有重要作用。其快速更新的特性，使其成为研究细胞增殖和分化调控机制、营养素对肠上皮研究细胞增殖和分化调控机制、营养素对肠上皮的作用、细胞信号转导、肠道免疫等提供了理想的作用、细胞信号转导、肠道免疫等提供了理想的体外模型。的体外模型。胶原酶胶原酶消化法得到的兔消化法得到的兔IEC鸡胚盲肠上皮细胞呈铺鸡胚盲肠上皮细胞呈铺石路生长（石路生长（400）准备工作准备工作1、对所需用到的器皿的清洗、干、对所需用到的器皿的清洗、干燥、消毒燥、消毒2、培养基和其他试剂的配制、分、培养基和其他试剂的配制、分装及灭菌装及灭菌3、无菌室或超净台的清洁与消
3、毒、无菌室或超净台的清洁与消毒4、培养箱及其他仪器的检查与调、培养箱及其他仪器的检查与调试试IEC的培养流程的培养流程幼龄动幼龄动物小肠物小肠单个单个细胞细胞细胞细胞悬液悬液细胞贴细胞贴壁生长壁生长细胞细胞悬液悬液细胞株或细胞株或细胞系细胞系剪碎剪碎胰蛋白酶胰蛋白酶原代培养原代培养胰蛋白酶胰蛋白酶传代培养传代培养 IEC的培养分为原代培养和传代培养。的培养分为原代培养和传代培养。分离细胞后立即进行培养称为原代培养，一般将分离细胞后立即进行培养称为原代培养，一般将培养的第培养的第1代与传代与传10代以内的细胞统称为原代细代以内的细胞统称为原代细胞培养；胞培养；存活的原代培养细胞（细胞株）进行传代
4、，称为存活的原代培养细胞（细胞株）进行传代，称为传代细胞培养。传代细胞培养。IECIEC的分离方法的分离方法机械解离法机械解离法酶学解离法酶学解离法螯合解离法螯合解离法胰蛋白酶消化法胰蛋白酶消化法胶原酶和中性胶原酶和中性蛋白酶结合法蛋白酶结合法胶原酶消化法胶原酶消化法嗜热菌蛋白酶法嗜热菌蛋白酶法影响影响IEC培养的因素培养的因素1、材料来源材料来源 以取自刚出生且未进奶的新生大鼠最好。以取自刚出生且未进奶的新生大鼠最好。对已进食的新牛大鼠，分离培养过程中使用的培对已进食的新牛大鼠，分离培养过程中使用的培养液、细胞洗涤液养液、细胞洗涤液(Hanks(Hanks液液)和组织分散液中均应和组织分散液
5、中均应加入加入2 2倍浓度的抗生素。倍浓度的抗生素。2、消化酶的选择消化酶的选择 用用0 02525胰酶消化组织，室温下需约胰酶消化组织，室温下需约1 h1 h，分离，分离得到的大部分为单个细胞，贴壁和生长能力均较得到的大部分为单个细胞，贴壁和生长能力均较差。差。胶原酶胶原酶与中性蛋白酶与中性蛋白酶I I的联合使用，室温消化约的联合使用，室温消化约40 min40 min即可得到即可得到IECIEC团块，其贴壁能力较强，牛长团块，其贴壁能力较强，牛长状态良好，还可减轻对细胞毒性损害，缩短消化状态良好，还可减轻对细胞毒性损害，缩短消化作用时间，且肠绒毛细胞团的产率较高。作用时间，且肠绒毛细胞团的
6、产率较高。用嗜热菌蛋白酶作为分离用嗜热菌蛋白酶作为分离IECIEC的消化酶，经简便纯的消化酶，经简便纯化，即可获得较纯的化，即可获得较纯的IECIEC。3、血清浓度血清浓度 使用胎牛血清浓度不宜过高，使用胎牛血清浓度不宜过高，10%-20%10%-20%胎牛血清常胎牛血清常使非肠黏膜上皮细胞增殖。使非肠黏膜上皮细胞增殖。IECIEC体外培养所用的胎牛血清的浓度一般不超过体外培养所用的胎牛血清的浓度一般不超过5%5%。4、IECIEC的纯度的纯度 少量异源细胞的存活对少量异源细胞的存活对IECIEC生长繁殖也是重要的，生长繁殖也是重要的，因为因为IECIEC与间质细胞存在相互作用关系。与间质细胞
7、存在相互作用关系。同时应防止其过度繁殖，如降低同时应防止其过度繁殖，如降低FCSFCS浓度可减少成浓度可减少成纤维细胞和平滑肌细胞增殖。纤维细胞和平滑肌细胞增殖。应用肝素可抑制平滑肌样细胞生长，促进应用肝素可抑制平滑肌样细胞生长，促进IECIEC生长生长增殖。增殖。5、培养基培养基 培养基以新鲜配制为佳，低温培养基以新鲜配制为佳，低温(4)(4)储存不宜超过储存不宜超过1 1周。周。EGFEGF对于促进对于促进IECIEC贴壁十分重要，它与胰岛素合用贴壁十分重要，它与胰岛素合用可促进可促进IECIEC生长繁殖。生长繁殖。生长基中加入表皮生长因子、胰岛素和谷氨酰胺生长基中加入表皮生长因子、胰岛素
8、和谷氨酰胺等更利于原代培养的上皮细胞生长。等更利于原代培养的上皮细胞生长。6、酸碱度、酸碱度 最适最适pHpH因细胞不同及动物种属不同而异。因细胞不同及动物种属不同而异。最适最适pHpH有利于细胞本身的酶及其他生长因子发挥有利于细胞本身的酶及其他生长因子发挥较好的效果，从而影响体外培养细胞的生存。较好的效果，从而影响体外培养细胞的生存。IECIEC培养最适培养最适pHpH值为值为7 72 27 74 4。IEC的鉴定的鉴定 用消化酶分离培养的细胞仅凭光学显微镜形态学用消化酶分离培养的细胞仅凭光学显微镜形态学观察不能鉴定为观察不能鉴定为IECIEC，尚需其他较为特意的鉴定方，尚需其他较为特意的鉴
9、定方法。法。1、碱性磷酸酶染色法、碱性磷酸酶染色法 影响因素多，阳性率低影响因素多，阳性率低。2、电镜法电镜法 用电子显微镜扫面观察细胞桥粒和刷状缘是鉴定用电子显微镜扫面观察细胞桥粒和刷状缘是鉴定上皮细胞很有效的方法，但价格昂贵。上皮细胞很有效的方法，但价格昂贵。3、免疫荧光法免疫荧光法 采用特异的抗人上皮细胞膜抗原或角蛋白，特异采用特异的抗人上皮细胞膜抗原或角蛋白，特异性强。消化酶从小肠黏膜分离下来的细胞类型主性强。消化酶从小肠黏膜分离下来的细胞类型主要有要有IECIEC、成纤维细胞和平滑肌细胞，成纤维细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞，成纤维细胞和平滑肌细胞上皮细胞膜抗原或角蛋白呈阴性，和平滑肌细胞上皮细胞膜抗原或角蛋白呈阴性，故免疫荧光染色检测阳性的细胞可确定为故免疫荧光染色检测阳性的细胞可确定为IECIEC。
小肠上皮细胞培养PPT课件
