分子发光分析技术及其应用(DOC)

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1、分子发光分析技术及其应用姓名：陈 虹学院：化学与化工学院专业：分析化学班级：2 0 0 9级分子发光分析技术及其应用引言分子吸收外来能量时，分子的外层电子可能被激发而跃迁到更高的电 子能级，这种处于激发态的分子是不稳定的，可以经由多种衰变途径而跃 迁回基态。这些衰变的途径包括辐射跃迁过程和非辐射跃迁过程，辐射跃 迁过程伴随的发光现象，称为分子发光。分子发光分析技术是以分子发光 作为检测手段的分析方法，其具有灵敏度高，选择性好，试样量少，操作 简便等优点，已在生物医学 1-8、药学 9-17以及环境科学 18-23等方面被广泛应 用。因此，分子发光分析技术成为近年来发展比较快的分析技术之一。 一

2、. 分子发光分析法1. 概述分子发光的类型 按分子激发的模式分为光致发光和化学发光或生物发光。如果分子通 过吸收光能而被激发，所产生的发光称为光致发光。如果分子是由化学反 应的化学能或由生物体（经由体内的化学反应）释放出来的能量所激发， 其发光分别称为化学反光或生物发光。按分子激发态的类型分为荧光和磷 光两个类型。2. 分子荧光与磷光光谱分析法2.1 荧光、磷光产生的机理 每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级，称为电子能极，而每个电子 能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。分子中电子的运动状态除了电子 所处的能级外，还包含有电子的多重态，用M=2S+1表示，S为各电子自旋量子 数的代数

3、和，其数值为0或1。根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据 的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。若分子中所有电子都是自旋 配对的，则S=0,M=1该分子便处于单重态（或叫单重线），用符号S表示。大多数 有机化合物分子的基态都处于单重态。基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程 中，不发生自旋方向的变化，这时仍然是M=1，分子处于激发的单重态；如果 电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便具有两个自旋不配对的 电子，即S=1,M=3，分子处于激发的三重态，用符号T表示。处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比自旋配对更稳定些（洪特规则）， 因此在同一激发态中，三重态能级总

4、是比单重态能级略低。处于激发态的分子是很不稳定的，其可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁形式支 活化（去激发）释放出多余的能量而返回基态。辐射跃迁主要涉及到荧光，延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁是指以热的 形式释放多余的能量，包括振动弛豫、内部转移、系间跨越及外部转移等过程。2.2 激发光谱和发射光谱 荧光和磷光均属于光致发光，所以都涉用到两种辐射，即激发光 （吸收）和 发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。它们是荧光和磷 光定性和定量分析的基本参数及依据。（1）激发光谱 通过测量荧光（或磷光）体的发光通量（即强度）随激发光波长的变化而获得的 光谱，称为激发光谱。激发光谱的具体测绘方

5、法，是通过扫描激发单色器，使不 同波长的入射光照射激发荧光（磷光）体，发出的荧光（磷光）通过固定波长的发射 单色器而照射到检测器上，检测其荧光（磷光）强度，最后通过记录仪记录光强度 对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。通过激发光谱，选择最佳激发波长发射荧光（磷光）强度最大的激发光波长，常用九表示。ex（2）发射光谱，也称荧光光谱或磷光光谱 通过测量荧光（或磷光）体的发光通量（强度）随发射光波长的变化而获得的光 谱，称为发射光谱。其测绘方法，是固定激发光的波长，扫描发射光的波长，记 录发射光强度对发射光波长的关系曲线，即为发射光谱。通过发射光谱选择最佳 的发射波长发射荧光（磷光）强度最大的发射

6、波长，常用Xem表示，磷光发射 波长比荧光来得长。2.3 荧光量子产率 激发态分子的去激发包括两种过程，即无辐射跃迁过程和辐射跃迁过程，辐 射跃迁可发射荧光（延迟荧光）或磷光。而有多少比例的激发分子发射出荧光（或磷 光）,可以用荧光量子产率F-有时也叫荧光效率或荧光产率（或磷光量子产率申p） 表示。作定义为：荧光物质吸光后所发射荧光的光量子数与所吸光的光量子数 之比，即：.发射的光量子数 吊.发M荧光的分子数一吸收的光量子数%一吸收荧光的另子数许多吸光物质并不能发射荧光，这是因为激发态分子的去激发过程中，除发 射荧光（磷光）外，还有无辐射跃迁过程与之竞争。所以，荧光量子产率与其他各 种过程的速

7、率常数有关。因此，oF可以表示为：F式中，LKi为无辐射跃迁各种过程的速率常数之和，即LKi =KC+Ksc+ KqQ。从上式可以看出，凡是能使0值升高而使其它Ki值降低的因素，都可以提高量子产量，增强荧光。对于高荧光分子(如荧光素)来说，f接近于1,说 明该分子的Kf较大，LKi相对于Kf可忽略不计。一般荧光物质f小于1,不发 荧光的物质Kf为0，f=0。一般说来，Kf主要取决于化学结构(上节已叙述)， Ki则主要取决于化学环境的因素，同时也与化学结构有关。从各种速率常数还可 以得到荧光寿命Tff:1磷光的量子产率p与荧光最子产率相似。3. 化学发光分析法3.1 化学发光的基本原理某些物质在

8、进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产 物分子激发到激发态，受激分子由激发态跃迁回基态时以辐射形式发出一定波长 的光。这种吸收化学能使分子发光的过程，称为化学发光。利用化学发光建立起 来的分析方法称为化学发光分析法。化学发光也发生在某些生物体系内，称为生 物发光。化学发光分析法的特点是，灵敏度高，选择性好，仪器设备简单，分析 速度快。化学发光是基于化学反应所提供的化学能使分子激发而发射光的，任何一 个化学发光反应都包含有活性激发和发光两个关键过程，它必须满足下列条件：(1) 化学反应必须提供足够的激发能，激发能的主要来源是反应焓。能在可 见光范围发生化学发光的物质，其激发能A

9、E通常是在150400KJmol-i范围。 许多氧化还原反应的反应焓与此相当，因此大多数化学发光反应为氧化还原反 应。(2) 要有有利的化学反应历程，使反应产生的化学能用于不断地产生激发态 分子。对于有机化合物的液相化学发光来说，芳族化合物和羰基化合物更容易生 成激发态的产物。(3) 激发态分子跃回基态时，要能释放出光子，或激发态分子能将能量转移 给另一种分子，使该分子受激后发射光子。总之，激发态分子不能以热的形式损 失能量。化学发光反应的化学发光效率口，又称为化学发光的总量子产率。它决定 于生成激发态产物分子的化学激发效率中號和激发态分子的发射效率 。定义为:发射光子的分子数. 参加反应的分

10、子数3.2化学发光反应的类型3.2.1 直接化学发光和间接化学发光 化学发光反应可分直接发光和间接发光。直接发光是被测物作为反应物直接 参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。表示 如下:A+BC*+DCC + hu式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*,当C*跃迁回基态 时，辐射出光子。间接发光是被测物A或B通过化学反应后生成初始态C*，C*不直接发光， 而是将其能量转移给F,使F处于激发态，当F*跃迁回基态时，产生发光。如下 式表示A+BC* + DC* + FF*F*F+hu式中C*为能量给予体，而F为能量接受体。3.2.2 气相化学发光和液相化学发

11、光气相化学发光主要有 O3、NO、S 的化学发光反应，可用于监测空气中的 O3、NO、NO2、H2S、SO2和 CO 等。液相化学发光 用于这一类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛 粉碱等，其中鲁米诺（Lominol ）化学发光反应机理研究得最久，其化学发光体 系已用于分析化学测量痕量的 HO 以及 Cu、 Mn、 Co、 V、 Fe、 Cr、 Ce、 Hg 和 Th 等金属离子。二. 分子发光分析法的应用1. 荧光、磷光分析的应用荧光分析法目前主要用于无机物24-25和有机物的定量分析，但随着其研究的 深入，在定性分析、结构分析及作为某些研究领域的手段也日渐增多，具有较为 广阔的应用

12、前景。磷光分析法主要用于有机化合物的测定，如稠环芳烃 26和石油产品27的分 析，农药、生物碱28和植物生长激素的分析，药物和临床分析等。此外磷光分析 技术也已应用于生物活性物质的化验及细胞生物学、生物化学等方面的研究。2. 化学发光分析的应用化学发光分析最大的特点是灵敏度高，对气体和痕量金属离子的检出限都可 达ngcm-3级。在环境检测中化学发光法比吸收光谱法和微库仑法具有更高的灵 敏度，又能进行快速连续分析，因此气相化学发光反应已广泛用于空气中有害物 质如03、氮氧化物CO、SO2、H2S等的监测。其测定灵敏度可达13ngcm-3。 液相化学发光反应，如鲁米诺、光泽精、没食子酸等发光体系可

13、测定天然水和废 水中的金属离子。在医学、生物学、生物化学29和免疫学30研究中，化学发光分 析也是一种重要的手段。下面综合介绍一些荧光、磷光及化学发光的具体应用。(1) 空气中痕量苯的测定饶志明19等自组装了一种新型的热解吸 /化学发光的仪器系统 ，据此建立 了一种测定空气中痕量苯的新方法 ，并对比研究了不同吸附剂对苯的吸附性能。 实验表明，Tenax- T A (2 6-二苯基对苯醚的多孔聚合物)对空气中低浓度的苯 具有较好吸附效果。当从吸附剂解吸的苯蒸汽通过氧化钇 (Y2O3 )粉体表面时， 其催化发光强度与苯浓度在相当宽的范围内呈良好的线性关系，其线性范围为 0.4444 mg/m3(

14、r = 0.9991 ， n = 9) ，检出限为 0.1 mg/m3 (S /N = 3) ； 对浓度 为0.44 mg/m3的苯气体平行测定了 9次，其相对标准偏差为4.45%； Tenax-GR (2， 6-二苯并呋喃聚合物树脂加上 30%石墨碳 )对低浓度苯的吸附效果更好，其 线性范围为 0 . 2222 mg/m3( r = 0.9922， n = 9) ； 检出限为 0.07 mg/m3(S /N = 3)。本方法耗时短、 简便快速，成功实现了对苯的实时在线检测。(2) 环境水样中亚硝酸盐的测定龚正君20等研究发现，酸性亚硝酸根与碱性鲁米诺反应产生很强的化学发 光 ，从而建立了亚硝

15、酸根在线分析化学发光新方法。此法测定亚硝酸根的线性 范围为 3.3 X10 - 33.3g/ mL，标准曲线是 I = 729.09 c + 36. 3 ( n = 13, R2= 0.993),相对标准偏差为 1.03 %(0.17p g/ mL 亚硝酸根，n = 11)和 4.38 %(0.017 卩g/ mL亚硝酸根，n = 11)，检出限为1.6 X 10 - 3p g/ mL。将此法运用于环境 水体中亚硝酸根的监测，具有灵敏度高、线性范围宽和不产生二次污染的优点。 高岐21等也将亚硝酸根在酸性介质中氧化亚铁氰化钾为铁氰化钾和鲁米诺铁 氰化钾尿酸化学发光反应偶合一起，建立了一种间接测定

16、亚硝酸根的新方法。 讨论了酸度、 反应物浓度、 干扰离子等因素的影响。方法的检出限为 5.0Xl0- 9g/mL，对环境水样样品进行了平行测定(n= 11)，其相对标准偏差为1.9 3.3% ，线性范围为 l.0Xl0-7 1.0Xl0-5g/mL ，回收率为 94.45 105.5% 。 方法简便， 易于操作，并具有较高的灵敏度和选择性，结果令人满意。(3) 环境水样中微量碘的测定碘是人体必需的微量元素之一 ,直接与人体的新陈代谢和生长发育有关 , 参与甲状腺素的合成 ,而且还影响着人们的大脑的发育。所以 ,样品中碘的测定 有着十分重要的意义。高岐23等研究了高锰酸钾-甲醛-I-化学发光体系

17、，建立了一种测定环境水样 中微量碘的新方法。讨论了各种反应物浓度、 酸度、干扰离子等因素对测定结 果的影响。-浓度在1.0 X10- 74.0 X10- 6g/ mL范围内与化学发光强度有较好 的线性关系。对1.0 X10 - 6g/mL的I-进行了(n=11)平行测定，相对标准偏差 为3.1 %，方法的检出限为2.4 X10- 9g/ mL。(4) 水中油含量的测定一般来说水中的油包含了许多种成分，但是其中芳香烃类物质在水中油所占 的比例，在特定的场合一般来说是稳定的，可以说芳香族化合物是水中油的晴雨 表，因此，通过检测芳香烃来判定水中油的含量在环境检测中得到了广泛认可。孙刚26提出并研究设

18、计了基于荧光分析法的芳香烃光学检测系统，它具有测 量精度高，误差小，操作简单，环保无污染等特点。在 254nm 的紫外线照射下， 只有芳香烃类物质会产生波长为 352nm 的荧光，根据芳香烃的这一特性，我们 就可以对其进行定性分析。此外，荧光物质发射的荧光强度与溶液浓度之间存在 线性关系，因此我们就可以通过检测芳香烃类物质产生的荧光强度来定量测量溶 液的浓度。(5) 汽油中铅的测定唐守渊囚等利用铅(II)催化H2O2氧化Luminol产生化学发光的反应，采用 流动注射分析技术，在分离共存干扰离子基础上，在鲁米诺中加入 EDTA 作为 增敏试剂，有效提高了测试反应的检测灵敏度，对分解后的汽油样品

19、中铅(II)含 量进行了化学发光法测定，铅(II)的含量在0.5100 p gml-1内与发光强度呈 线性关系，方法检出限达0.1 p g ml- 1 o(6) 毒品中生物碱的测定刘彦明28等提出了毛细管电泳电致化学发光同时分离检测盐酸甲基麻黄碱、 蒂巴因、磷酸可待因和乙酰可待因的新方法。对电泳分离条件、电致化学发光检 测条件和离子液体的影响进行了系统优化，将提出的新方法成功应用于人尿样中 4 种毒品含量的分析，结果令人满意。(7) 香椿叶中总黄酮含量的测定 常永芳31等采用荧光分光光度法测定香椿叶中总黄酮含量。该法根据黄酮类化合物的荧光性质，以芦丁为标样,在激发波长入ex =436 nm、发

20、射波长入em = 505 nm 条件下，考察了溶剂、 pH 值、表面活性剂及放置时间对荧光强度的影响。 结果在浓度 95%乙醇中加入 pH 值为 7 的缓冲液，芦丁的荧光强度最大。该方法 检测限为 2.62 X 10- 7mol /L,线性范围在 1.16 X 10- 74.86 X 10- 5mol /L 之 间，相对标准偏差为 1.07%。该法准确度和精密度都较高,且操作简便,成本低。(8) 环己烷存在下环糊精诱导菲的室温磷光测定 陈璞32等讨论了非除氧条件下的重原子效应、 环己烷及超分子化合物环 糊精用量对菲的室温磷光影响因素 ,建立了环己烷存在下环糊精诱导菲的室温 磷光分析法。环己烷存

21、在下，非除氧时菲的线性范围为8.0 X 10-86.0 x 105mol /L,相对标准偏差为0.717%，最低检出限为8.8 X 10- 8mol /L。(9) 化学发光法对食品中苏丹红I的测定时作龙33等以苏丹红I作模板分子，用悬浮聚合法制备出微米级苏丹红I 分子印迹聚合物并将其做成微固相萃取柱，直接安装在流动注射系统的八通阀 上，对样品溶液中的苏丹红I进行在线分离和富集；经甲醇和甲酸混合洗脱液 (体积比 2 ：1)在线洗脱后与酸性高锰酸钾发生化学发光反应。据此建立了在线 分子印迹微固相萃取，高锰酸钾氧化苏丹红化学发光测定食品中苏丹红I的新 方法。结果表明，测定的苏丹红I线性范围为1.0

22、x 10- 67.0 X 10- 4g/L，方 法检出限(30 )为3 X 10- 7g/L， 11次平行测定1 X 10- 5g/L苏丹红I溶液 的化学发光强度相对标准偏差为 2.0% 。(10) 化学发光法检测番茄提取物清除自由基的能力番茄中含有丰富的类胡萝卜素，它是一类重要的天然抗氧化剂。田云34等以 新鲜番茄为原料 ，采用化学溶剂浸提法提取抗氧化类胡萝卜素，利用微弱化学发 光法检测其清除自由基的能力 ，结果表明番茄提取物具有很强的清除自由基的 能力。(11) 氨基酸的测定郎惠云35等基于碱性条件，氨基酸对次氯酸钠-鲁米诺化学发光体系的显著 增敏作用，建立了反相流动注射-化学发光法测定氨

23、基酸的新方法。该法不需对 氨基酸进行衍生或转化，检出限为0.016m g/mL，采样频率为150次/ h，对1 M g/mL的组氨酸进行连续12次平行测定，其RSD为0.9 %。对氨基酸注射液 样品中的氨基酸测定的回收率在98. 6 %102. 1 % 之间，并和经典的茚三酮比 色法进行了对照。参考文献1 Xiaodong Shaoa, Xin Li, Bei Liu. Determination of Cefetamet Pivoxil in Human Urineand Serum Using Flow Injection Chemiluminescence ProcedureJ.(200

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