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1、植物总植物总DNADNA的提取的提取化学生物学实验中南民族大学 药学院化学生物学教研室1.实验目的实验目的12 学习和掌握学习学习和掌握学习CTAB法提取植法提取植物总物总DNA的基本原理和实验技术。的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。的纯度和浓度。2.实验原理实验原理 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的
2、处理下，结合 65 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品，纯的RNA样品，并且1g/ml DNA溶液。3.实验器材与试剂实验器材与试剂1、高压灭菌锅、高压灭菌锅2、冰
3、箱、冰箱3、恒温水浴锅、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计、紫外分光光度计6、剪刀、剪刀7、陶瓷研钵和杵子、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管、滴管10、细玻棒、细玻棒11、小烧杯（、小烧杯（50ml）12、离心管（、离心管（50ml）13、植物材料、植物材料3.实验器材与试剂实验器材与试剂1、3CTAB buffer（）（）100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3%CTAB 2%-巯基乙醇巯基乙醇2、TE缓冲液（）缓冲液（）10mmol/L TrisHCl 1mmol/L EDTA3、氯仿、氯仿-异戊醇混合液（异
4、戊醇混合液（24：1，V/V）4、95乙醇乙醇5、液氮、液氮4.实验步骤实验步骤1、称取新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。、称取新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。2、将叶片剪成、将叶片剪成l cm长，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研磨成长，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研磨成 粉末。粉末。3、将液氮挥发完后，加入、将液氮挥发完后，加入0.5 ml预热（预热（60）的）的CTAB提取缓冲液，转入提取缓冲液，转入 一离心管中，置于一离心管中，置于65水浴保温水浴保温0.5 h，不时地轻轻摇动混匀。，不时地轻轻摇动混匀。4、取出稍冷后，加等体积的氯仿：异戊
5、醇混合液，轻轻颠倒混匀，室温下、取出稍冷后，加等体积的氯仿：异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，室温下 7000 rpm离心离心10 min。5、用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加、用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加2倍体积倍体积 的乙醇（的乙醇（95%乙醇），轻轻混匀，使核酸沉淀下来，室温下乙醇），轻轻混匀，使核酸沉淀下来，室温下10000 rpm 离心离心10 min。6、倒掉上清夜，向离心管中加、倒掉上清夜，向离心管中加1 ml洗涤缓冲液，轻轻转动离心管，使核酸洗涤缓冲液，轻轻转动离心管，使核酸 沉淀悬浮起来，洗涤沉淀悬浮起来，洗涤2 min，在室温下，在
6、室温下5000 rpm离心离心5 min。7、重复洗涤一次，并于室温下使、重复洗涤一次，并于室温下使DNA沉淀干燥，变为透明状。沉淀干燥，变为透明状。8、将、将DNA沉淀溶于沉淀溶于100l TE溶液中，于溶液中，于-20保存备用。保存备用。9、用于后续浓度及纯度的检测，将、用于后续浓度及纯度的检测，将DNA沉淀溶于沉淀溶于1 ml TE溶液中，在分光溶液中，在分光 光度计上测定该溶液在光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的吸光度值。紫外光波长下的吸光度值。5.注意事项注意事项1.液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。2.所有操作均需温和，避免剧烈震荡。所有操作均需温和，避免剧烈震荡。6.思考题思考题1.CTAB、EDTA、巯、巯基乙醇的作用分别基乙醇的作用分别是什么？是什么？2.液氮研磨的原理是液氮研磨的原理是什么？什么？
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