红色荧光蛋白的表达

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1、红色荧光蛋白的表达闫艺 2013141241115卫静丽 2013141241105红色荧光蛋白表达的技术路线人致如下：具体操作可分为四个阶段：1、质粒DNA的提取及检测2、DNA的限制性内切酶酶切及连接重组3、重组质粒扩增4、菌落PCR鉴定阳性克隆及诱导表达1质粒DNA的提取及检测1菌种接种根据所选择的荧光蛋白基因的菌种进行接种：DH5 a -pDsRedl-Nl （红色）卡那霧素抗性DH5 a -pET- 28a （表达载体）卡那壽素抗性接入LB液体培养基6ml+12 u 1 （20mg/ml）kana37C培养过夜1.2碱裂解法提取质粒1）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，

2、10000rpm,2mm,弃上清液。2）加入100 uL溶液I,漩涡器上充分混匀，在室温下放置lOnuiio3）加入200 u L新配制的溶液11 ,轻轻翻转23次，使之混匀，冰上放置5 mm。4）加入150 uL冰冷的溶液III,加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物,冰上放置15 mnio 100001-pm,5 mm,取上清液于另一干净的离心管中。5）向上清液中加入等体积（约400 P L）酚/氯仿/异戊醇（25【24:1, v/v）,振荡 混匀，10000ipm,10 nun,将上清液转移至新的离心管中。加入等体积（约370 y L）氯仿/异戊醇（24:1）,混匀，10OOOrpm,

3、2min ,取上清 液于新离心管中6）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置30nuiio7）12000ipm,5 nun,倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。8）加0.8111L70%乙醇，离心1 min,倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30mnio9）加 30 u L ddH20 , -20C保存备用。1.3DNA琼脂糖凝胶电泳检测13.1琼脂糖凝胶板的制备1）称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30111L1XTAE缓冲液，微波炉加热直 至琼脂糖溶解。2）待胶液冷却到65C （不烫手为宜），加入luLGoldview混匀，搅拌器上搅拌 排除气泡，（如右图）缓慢倒

4、入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳 子）内。静置30mm左右，轻轻晃动拔出梳子。1.3.2、加样胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极）,注入1 XTAE缓冲液淹没过胶板1mm, 用取液器将提取的质粒DNA5 u L与1 u L Loading Buffer （ 6X ）混匀,加入胶 板的样品小槽内。1.3.3电泳将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动 到距离胶板边沿约l2cm处，停止电泳。1.3.4观察和拍照将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为2541UH的紫外 灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。2、DNA的限制性内切酶酶切

5、及连接重组2.1DNA限制性内切酶酶切2.1.1分别取两支0.2mlEP管做上记号：如 2.1.2两个EP管中分别配置下列的30 UL体系:EP管EP管BSA3 pLBSA3 uL10 X buffer3 uL10 X buffer3 pLNot 12 pLNot I2 uLBam H I2 pLBam H I2 uLpET-28a20 uLpEGFP-N320 uL2.1.3将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱370C酶切3ho2.1.4取5 u LEP管的酶切反应液，同时取5 u L原质粒溶液作对照，进行 电泳检测酶切结果。2.1.5按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段2.2D

6、NA的连接重组2.2.1在EP管中分别配置下列的体系：0.2ml EP 管10 X buffer2 uL酶切后的pET-28aX uL酶切后的EGFPY uLT4DNA连接酶（考虑连接效率）2 uLX : Y= 1 : 310,用水补足20 pLo2.2.2 EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱16C反应过夜后，-20C下保存 用于转化。3、重组质粒扩增31感受态细胞细胞制备1）挑取适当菌株的E.coli单菌落接种于2mlS0B培养液中，37C摇过夜。2）取0.5-lnil过夜培养的菌液转种到50mlSOB中，18C剧烈震荡，到Agoo达0.6。3）将培养物转移到50ml离心管中，4C、40

7、001 10mm,同时在冰上配制TB 溶液。4）弃上清，将离心管倒置在滤纸上，使培养液被吸干。5）取1ml刚配制的TBaq打散菌体沉淀，再加入15mlTB （1/3体积的起始培养 液）,冰浴 10-15min, 4C、4000r lOrnrn.6）弃上清，沉淀重悬于4mlTB （1/12.5体积的起始培养液），冰浴10mm.7）加入280 U1DMSO,缓缓滴入并轻轻摇晃，使其混合均匀，冰浴lOnun.8）将菌液分装于EP管中，-80C或液氮冻存。3.2转化3.2.1取出感受态细胞让其在冰上自然解冻，每200 uL解冻的感受态细胞加入 整管连接产物，混匀后冰浴30mino3.2.2 42C金属

8、浴中热激90秒，立即置于冰浴5mm。3.2.3再在感受态细胞混合物中加入0.8niL的LB培养基，于37C摇床中培养11】。3.2.4 1h后，6000i7nun离心3mm,去掉上清（约留200 u L的培养液），摇匀 菌块。3.2.5用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含Kana的LB固体培养基上，正置培养皿 半小时后，37C培养箱中倒置培养皿过夜。326第二天早上观察结果。4菌落PCR鉴定阳性克隆及诱导表达4.1菌落PCR鉴定阳性克隆1）在0.2mLEP管内配制25 uLPCR反应体系1个:反应物体积（PL）ddH201&510 X Buffer2.5MgC121.54X dNTP1引物10.5引

9、物20.5Taq酶0.5菌落挑1个2）用灭菌枪头挑单菌落接触EP管内，混匀瞬时离心。3）放入PCR仪中，设置反应程序： 94 C预变性5min： 94 C变性30S； 55 C退火30S； 72 C延伸60S； 重复步骤血30次； 72 C延伸10mm。4）取9 uL反应液加1 PL10 X loading Buffer做电泳检测，分析所得目的片段 的大小。4.2提取重组质粒转入BL21中诱导荧光蛋白表达1）取出感受态细胞BL21让其在冰上自然解冻，每200 uL解冻的感受态细胞加 入5 uLpET-28a-RFP质粒,混匀后冰浴30mm。2）42C热冲击90秒，立即置于冰浴5nuiio3）再将感受态细胞混合物转入0.8mL的LB培养基，于37C摇床中培养山。期 间将200 uL的24mg/ml IPTG涂布在含Kana的LB培养基上，待用。4）lh后，600017mm离心5mm,去掉上清（约留200 n L的培养液）,摇匀菌 块。5）用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含IPTG和Kana的LB固体培养基上，正置 培养皿半小时后，37C培养箱中倒置培养皿过夜。6）第二天早上观察结果。