生物分离技术层析技术课件

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1、12.10 层析技术层析技术u历史和概念u分类u常用的层析技术u薄层层析法u气相色谱技术u高效液相色谱技术u固相萃取技术22.10.1 历史和概念历史和概念层析层析Chromatography1903,Tsweett M.茨维特茨维特碳酸钙碳酸钙石油醚洗脱石油醚洗脱层析法，最早层析法，最早用于有色物质用于有色物质分离，因此也分离，因此也叫色谱法，色叫色谱法，色层法层法3层析技术的发展历程层析技术的发展历程u1931年Kuhn等在氧化铝和碳酸钙柱上制备性的分离了,-胡萝卜素u1941年，Martin和Synge采用水分饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸，建立了分配层析u

2、1951年，Martin和James报道了用自动滴定仪作检测器分析脂肪酸，创立了气-液色谱法，促进了色谱理论的形成u1958年，Golay首先提出了分离效能极高的毛细管柱气相色谱法u1960年代，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代 4是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相为流过固定相的气体或液体，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。5u固定相固定

3、相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。u流动相流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂洗脱剂，薄层层析时称为展层剂展层剂。6u吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。例如以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为：有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。789

4、石油醚石油醚环己烷环己烷四氯化碳四氯化碳苯苯氯仿氯仿乙醚乙醚乙酸乙酯乙酸乙酯丙酮丙酮吡啶吡啶乙醇乙醇甲醇甲醇水水乙酸乙酸10根据层析分离机制柱层析薄层层析纸层析薄膜层析气相(气-液;气-固)层析液相(液-液;液-固)层析根据两相所处状态根据操作形式不同2.10.2 层析法分类层析法分类112.10.3 各种层析技术各种层析技术吸附层析吸附层析u吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。u主要吸附力：吸附能（化学吸附、物理吸附）u吸附剂吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等

5、。u水分、粒度、吸附物分子大小、极性、特殊化学基团等对各种吸附剂吸附力有影响1213u对极性生物碱在硅胶上死吸附特别严重，可采用哪些途径调节实验？14吸附层析代表之一吸附层析代表之一 活性炭层析活性炭层析u非极性吸附剂（C-C键为主体），一般用于纯化、分离一般用于纯化、分离水溶性物质水溶性物质（也可用于非极性和弱极性），如甙类、氨基酸类、糖类u前处理：一般先过筛，用稀盐酸洗涤，稀碱洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于120 干燥45h后即可 u颗粒活性炭 or 粉末活性炭？u作为非极性吸附剂，水溶液中吸附强，有机溶剂中吸附弱u活性炭的内表面可高达1000m2/g 硅胶600m2/g15u研究认为

6、，分子量在5003000是活性炭可能吸附的范围，并随分子量的增大，吸附容量减小161718u纤维活性炭新型的高性能活性炭吸附材料u它是利用超细纤维如黏胶丝、酚醛纤维或腈纶纤维等制成毡状、绳状、布状等，经高温(1200K以上)炭化，用水蒸气活化后形成的。u纤维活性炭的表面积大，高达1700m2/g，密度小(515kg/m3)，微孔多而均匀，绝大多数为0.00150.0030m的小孔和中孔，因而吸附容量大，吸附和脱附速率高，残留量少，使用寿命长.u吸附能力比一般的活性炭高出110倍，特别是对于一些恶臭物质的吸附量比颗粒活性炭要高40倍左右。19吸附层析代表之二吸附层析代表之二 氧化铝柱层析氧化铝柱

7、层析u酸性氧化铝pH约为44.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5（仍属于碱性吸附剂范畴），用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为910，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物分离生物碱、胺和其它碱性化合物等有独特的优势。u醛、酮、酸、内酯等类型不易采用中性、碱性氧化铝分离u粒度：100160目20u氧化铝的吸附活性与含水量关系极大，一般在200 左右加温46h活化，然后按照下表加入一定量水来定等级，层析用氧化铝通常为 级。u氧化铝价格便宜，吸附量强于硅胶，对杂质吸附能力强于硅胶活性加入水量（%）036101521用氧化铝柱分离长春碱和长春新碱的范例用氧化铝柱分离长春

8、碱和长春新碱的范例长春花碱(抗肿瘤药物)，英文vinblastine，用于何杰金氏病，淋巴细胞瘤，组织细胞淋巴瘤，组织细胞增生症X，晚期睾丸肿瘤，对其它化药物耐受的绒癌及乳腺癌。长春花 Herba Catharanthi rosei，别名别名：雁来红、日日新、日日春、天天开天天开，为夹竹桃科植物长春花Catharanthus roseus(L.)G.Don的全草 22长春花总碱溶于甲醇长春花总碱溶于甲醇长春花总碱的硫酸盐沉淀长春花总碱的硫酸盐沉淀长春花总碱的硫酸盐水溶液长春花总碱的硫酸盐水溶液氯仿萃取长春花总碱氯仿萃取长春花总碱氯仿液用无水硫酸钠干燥后减压蒸干氯仿液用无水硫酸钠干燥后减压蒸干2

9、3长春花总碱浸膏长春花总碱浸膏1g上上30g氧化铝柱（氧化铝柱（级级），柱内径），柱内径柱长柱长=110重蒸的苯和氯仿混合溶液（比重重蒸的苯和氯仿混合溶液（比重1.3）洗脱）洗脱分段收集并采用氧化铝薄层色谱进行检测分段收集并采用氧化铝薄层色谱进行检测合并相同流分，蒸干后溶于乙醇，制成硫酸盐析出结晶合并相同流分，蒸干后溶于乙醇，制成硫酸盐析出结晶长春碱和长春新碱在1%硫酸铈铵的磷酸溶液下显紫红和灰蓝色氯仿-乙醚-石油醚(10:10:1v/v)为展层剂24u通常所说的硅胶层析之一为吸附硅胶层析，载体硅胶具有多孔性的硅氧环（mSiO2nH2O）。u硅醇基显较弱的酸性。u在甲醇和水中溶解度为在甲醇和水

10、中溶解度为0.01%，pH大于大于9时溶解度急时溶解度急剧上升剧上升。吸附层析代表之三吸附层析代表之三 硅胶层析硅胶层析25u硅胶活化：110 下烘干12h，其吸附性也随着水分的增加而降低，超过超过12%，吸附力极弱，不能，吸附力极弱，不能用作吸附层析用作吸附层析，只能作为分配层析的载体。u硅胶能吸附极性、非极性，饱和、不饱和分子，具有吸附层析和分配层析的双重特性。u硅胶是中性偏酸性颗粒，且制备中接触强酸，常带酸性，又是弱酸性阳离子交换剂。u前处理：检查水浸膏pH（不低于5），否则水洗至中性，110 下烘干24h。特殊要求下需要经过6mol/L盐酸及氯仿等预洗。26u干装和湿装u干装时，先在柱

11、底塞上少许玻璃纤维，再加入一些细粒石英砂石英砂，然后将准备好的吸附剂用漏斗慢慢加入干燥的色谱柱中，边加入边敲击柱身，务必使吸附剂装填均匀，不能有空隙。吸附剂用量应是被分离混合物量的3040倍，必要时可多达100倍。加够以后，在吸附剂上覆盖少许石英砂。u湿装时，将准备好的吸附剂用适量展开剂调成可流动的糊，如干装时一样准备好色谱柱，将吸附剂糊小心地慢慢加入柱中（提前放一半柱体积的展开剂），加入时不停敲击柱身，务必使吸附剂装填均匀，不能有气泡和裂隙，还必须使吸附剂始终被展开剂覆盖。一般柱层析步骤一般柱层析步骤1）装柱装柱272）洗柱）洗柱u干柱在使用前要洗柱，目的是排除吸附剂间隙中的空气，使吸附剂填

12、充密实。洗柱时从柱顶由滴液漏斗加入所选的展开剂，适当放开柱下端的旋塞。加入时先快加，再放慢滴加速度，使吸附剂始终被展开剂覆盖。洗柱时也要轻敲柱身，排出气泡。283）上样和洗脱）上样和洗脱u上样也分为干法和湿法u干法为用比填料颗粒大的干燥硅胶加入待上样的溶液中，搅拌吸附样品后干燥成均匀的粉末后上样u将待分离的混合物用最小量洗脱液溶解，小心加入柱中。待混合物溶液液面接近吸附剂上的石英砂时，旋开滴液漏斗旋塞，滴加展开剂。滴加速度以12滴/秒为适度。整个过程中，应使展开剂始终覆盖吸附剂。29正确选择层析柱，正确使用层析柱正确选择层析柱，正确使用层析柱30313233吸附层析代表之四吸附层析代表之四 大

13、孔吸附树脂大孔吸附树脂u大孔吸附树脂是一种不含交换基团不含交换基团的、具有大孔结构大孔结构的高分子吸附剂高分子吸附剂，也是一种亲脂性物质，它可以有效从很低浓度的溶液中吸附各种类型化合物（亲脂键、偶极离子、氢键等吸附方式，还有分子筛作用）。u装柱、上样、洗脱都比较简单，吸附量大，吸附速度快，选择性好，机械强度高，解吸附容易。按基团的极性可分为极性、非极性、中极性。u大孔吸附树脂的代表：三菱大孔吸附树脂三菱大孔吸附树脂HP20；国产；国产D101大孔吸附树脂大孔吸附树脂34CD180 丙烯酸系丙烯酸系 用于提取分离丁胺卡那霉素等氨基糖苷类半合成抗生素860021 苯乙烯系苯乙烯系 主要用于甜菊糖苷

14、、人参皂苷的提取精制，有机物的分离LK-002 脲醛系列脲醛系列 主要用于银杏黄酮、山楂黄酮、大豆异黄酮等的吸附提取LK-001 乙烯吡啶乙烯吡啶 主要用于甜菊糖甙等的吸附提取DM131 改进型树脂改进型树脂 苯乙烯系苯乙烯系 主要用于银杏黄酮、人参皂甙、茶多酚等物的天然药提取和精制，具有吸附量大、二乙烯苯残留量低的优点，符合FDA的药用要求3536大孔吸附树脂应用举例大孔吸附树脂应用举例u 氨基糖甙样品脱盐：氨基糖甙样品脱盐：将含盐的氨基糖甙，通过大孔吸将含盐的氨基糖甙，通过大孔吸附树脂，氨基糖甙被吸附，而盐溶液快速通过树脂柱附树脂，氨基糖甙被吸附，而盐溶液快速通过树脂柱，去盐后可用，去盐后

15、可用(10-20)%的含水醇或丙酮洗脱吸附物的含水醇或丙酮洗脱吸附物u 冬虫夏草有效成分的吸附分离冬虫夏草有效成分的吸附分离：H-103吸附树脂对核吸附树脂对核苷类化合物和芳香性氨基酸吸附，从而与糖类和非芳苷类化合物和芳香性氨基酸吸附，从而与糖类和非芳香性氨基酸分离。香性氨基酸分离。37巯基纤维素巯基纤维素nHMeRSMenRSHnn巯基棉纤维是将巯基巯基棉纤维是将巯基(HS-)连接在棉花的连接在棉花的大分子链上而制成。大分子链上而制成。巯基棉纤维对各种金属元素的结合能力有着明显的巯基棉纤维对各种金属元素的结合能力有着明显的差异，其强弱顺序基本上符合差异，其强弱顺序基本上符合软硬酸碱原则软硬酸

16、碱原则38uPt（）-Pd（）Au（）-Se（）Te（）As（）Hg（）-Ag（）Sb（）Bi（）Sn（）CH3HgIn（）-Pb（）Cd（）Zn（）u巯基棉对碱金属、碱土金属无亲和性（巯基棉对碱金属、碱土金属无亲和性（亲石元素亲石元素）；）；而对亲硫元素吸附性能好。各种亲硫的金属成分可与而对亲硫元素吸附性能好。各种亲硫的金属成分可与较高浓度的较高浓度的K、Na、Mg2、Ca2、Sr2、Fe3、Mn2、Cr3分离。分离。39巯基纤维素的应用举例巯基纤维素的应用举例u 化学发光测定水、血液和矿石中Cou Hg（）、Bi（）、Pb（）、Cu（）干扰Co的化学发光测定，如何去除？u在pH4条件下，让

17、试液流过巯基棉，干扰离子被吸附，流出液可直接测定。40还有哪些吸附材料？还有哪些吸附材料？u聚氨酯泡沫塑料聚氨酯泡沫塑料u纳米分离富集材料纳米分离富集材料u壳聚糖壳聚糖u磁微球磁微球u412.10.4 分配层析分配层析u分配色谱利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠涂布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。u吸附层析往往吸附过于强烈，分配层析则避免了这一缺陷。u纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相上的羟

18、基具有亲水性，吸附一层水作为固定相（12%20%的水），有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。42分配层析之一分配层析之一 纸层析纸层析影响纸层析的几大因素：物质的分子量物质的极性物质的电荷展开用的溶剂种类温度展开方式使用滤纸的种类其它43上行法上行法44下行法下行法45滤纸的选用对纸层析的影响滤纸的选用对纸层析的影响型号 标重(g/m2)厚度(mm)吸水性 灰分(%)性能 1900.17150-1200.08快速 2900.16120-910.08中速 3900.1590-600.08慢速 41800.34151-1210.08快速 51800.32120-

19、910.08中速 61800.3090-600.08慢速 46双向纸层析双向纸层析1、两相常为酸碱差异的两相如乙酸乙酯、95%乙醇、6mol/L HCl（8：1：1 V/V）为第一相，苯、丙酸、水（100：70：1 V/V）为第二相；2、第一相展开后，取出挥发有机溶剂至干，然后可直接放入第二相中层析。举例：大豆异黄酮双向举例：大豆异黄酮双向纸层析分析方法的研究纸层析分析方法的研究47薄层层析技术薄层层析技术48495051Cabinet喷雾抽气箱525354薄层层析优点薄层层析优点55流动相的更换方便流动相的更换方便，各种多元混合溶剂皆可选作展开剂，比高效被相色谱法所能选用的溶剂的范围宽。可充

20、分利用样品中各组分在多元混合溶剂中的分配系数差异，实现高效率分离。一个普通TLC理论板数可达到几百块，有利于一些复杂样品的分离。展开操作技术丰富多样展开操作技术丰富多样，如双向展开、圆形展开、多次展开、旋转展开等，以适用于各种复杂体系样品的分离与制备。56薄层色谱法缺点薄层色谱法缺点（1）实验的重现性差。不同的实验室，不同的操作者，甚至同一操作者的实验条件和结果很难完全重现，定量误差一般510。（2）实验条件和数据的可比性较差。引起误差的原因较多，如薄板的制作技术不良引起的薄层的厚度不均一；薄板的活化，贮放条件不严格引起的板的活度不规范；样品体系复杂等等，展开过程中展开剂的组成变化也是影响展开

21、结果的因素之一。57吸附剂的选择吸附剂的选择 硅胶硅胶 这是最常用的吸附剂，要求表面孔径在80100，粒度在2040m。硅胶硅胶H为不含粘合剂的硅胶；硅胶硅胶G含13-15的锻石膏(CaSO4.1/2H2O)；硅胶硅胶GF254是在硅胶中加入石膏和荧光指示剂，在波长为254nm的紫外光激发下发出黄绿色荧光，有紫外吸收的物质显色更清晰。0.5的羧甲基纤维素的羧甲基纤维素(CMC)58u氧化铝 应当注意氧化铝是一种具有催化活性的吸附刑，有可能引起试样发生一些化学反应，如引起等。所以氧化铝薄板的应用比硅胶板少。59u聚酰胺（腈纶、尼龙）聚酰胺（腈纶、尼龙）把聚酰胺粉铺成薄层板，可用于分离易生成氢键的

22、极性化合物，如酚类（鞣质）、黄酮、酸类（核苷酸、氨基酸）、醇类、醛、酮等。60uDNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析u第一向：苯第一向：苯-冰乙酸体系冰乙酸体系u第二向：甲酸第二向：甲酸-水体系水体系u显色：黄绿色荧光（显色：黄绿色荧光（DNS-氨基酸）氨基酸）61u络合薄层络合薄层硝酸银薄层u主要机理是由于C=C键能与硝酸银形成络合物，而饱和的C-C键则不与硝酸银络合。因此在硝酸银薄层上，化台物可由于饱和程度不同而获得分离，如碳原子相近的不饱和醇、酸；u饱和化合物由于吸附最弱而Rf最高，含一个双键的较含两个双键的Rf值高，含一个三键的较含一个双键的Rf值高。u顺式的与

23、硝酸银络合较反式的易于进行，可用来分离顺反异构体。62u薄层板的制作：手工、半自动、全自动、直接购买取硅胶G10g加30ml0.5CMC-Na水溶液，调成均匀糊状物，铺层于空气中晾干后，移至110烘箱活化30min（1051h），置于燥器中备用（）6364展开剂的选择方法展开剂的选择方法65u A组分组分通常为展开剂中极性小，比例大，它对样品不溶或微溶，在展开剂中主要是对样品起“输送剂输送剂”的作用。如单独使用，不能使样品的斑点移动。u B组分组分极性比A组分大，能使样品中各组分充分溶解，在展开过程中起“分配剂分配剂”作用。u C组分组分的极性介于A与B溶剂之间，是展开剂的“极极性调节剂性调节

24、剂”，使A和B能够互溶。66uD组分是组分是为改进样品中某些极性特别大的组分在展开中斑点拖尾或在原点不动，而加入强极性溶剂，如酸、碱等。其作用主要是“薄板的活性调节剂薄板的活性调节剂”。在展开剂中，D组分占的比例较小，必须严格控制加入量的准确性。67点样与展开点样与展开u点样时要控制点样量和点样次数。点样时要控制点样量和点样次数。一般：分析时几一般：分析时几到几十到几十微克，制备时几到几十毫克几到几十毫克u点样时，（点样时，（1）样品溶液必须是均一体系，应避免将）样品溶液必须是均一体系，应避免将非均相的混浊溶液点到纸或板上非均相的混浊溶液点到纸或板上。（2）溶液的浓度）溶液的浓度应在应在1左右

25、左右，太稀对加样体积增加，引起斑点扩散。（3）配制样品溶液的溶剂尽量选用易挥发、极性）配制样品溶液的溶剂尽量选用易挥发、极性较小的溶剂，较小的溶剂，样品溶液太稀时可分多次加样。6869（1）展开装置应密闭；（2）保持展开槽内展开剂的蒸气充分饱和，以消除“边边缘效应缘效应”边缘效应边缘效应(edge dffect)：点于同一薄层上同一物质的斑点，在色谱展开过程中，靠近薄层边缘处斑点的Rf值与中心区斑点的Rf值有所不同，此种现象称为边缘效应。70薄层层析的定位薄层层析的定位 对展开后的薄板进行定性与定量分析的前提是确认板上各组分的色班或色带的位置，通常称显色。常用的显色方法有紫外荧光法、蒸气显色法

26、和化学显色法等。71薄层色谱显色剂薄层色谱显色剂显色剂显色剂：有硫酸、碘的氯仿溶液、碱性高锰酸钾溶液、磷钼酸有硫酸、碘的氯仿溶液、碱性高锰酸钾溶液、磷钼酸等通用显色剂，等通用显色剂，也有根据化合物分类，或特殊官能团设计的专属性显色剂。1碘蒸气 对很多化合物显黄棕色。20.5碘的氯仿溶液 对很多化合物显黄棕色。3碘碘化钾溶液 对很多化合物显黄棕色。碘0.2g，碘化钾0.4g，加水到100m1。4 5磷钼酸乙醇溶液 喷后120烤，还原性物质（多羟基、烯烃、炔烃、醛类等）显蓝色，再用氨水熏，背景变为无色。7273u荧光薄层：u有些化合物本身无色，在紫外灯下也不显荧光或较弱，又无适当的显色剂时u吸附剂

27、中加入荧光物质制成荧光薄层进行层析，薄层板本身显荧光，样品斑点不显，但吸收紫外光形成暗斑。u254nm紫外光激发下显出荧光的，如锰激化的硅酸锌；365nm紫外光激发下发出荧光的，如银激化的硫化锌硫化镐74薄层层析的定性薄层层析的定性 原点至溶剂前沿的距离原点至斑点中心的距离比移值fR75薄层色谱定量分析薄层色谱定量分析u（1）溶剂洗脱）溶剂洗脱分光光度测定法，分光光度测定法，方法的误差在5以内，已成为国内外许多工业产品质量控制的标准化方法。u（2）在板上原位直接定量测定法）在板上原位直接定量测定法。即测定斑点的面积法，误差较大，一般1015之间；或测定斑点光密度法，误差较小，一般510。76薄

28、层层析在天然药物化学中的应用薄层层析在天然药物化学中的应用u1 证实两个天然化合物相同或同类；证实两个天然化合物相同或同类；u2 测定混合物中组分的数目；测定混合物中组分的数目；u3 决定适用于柱层析分离用的溶剂；决定适用于柱层析分离用的溶剂；u4 监控柱层析、萃取等分离过程；监控柱层析、萃取等分离过程；u5 监控一个反应的进程。监控一个反应的进程。77应用举例：文字色料的薄层色谱检验应用举例：文字色料的薄层色谱检验u确定种类、鉴定成分以确定产地、销售范围u民事案件：伪造、变造文书78圆珠笔油的染料成分检验圆珠笔油的染料成分检验正丁醇正丁醇-乙醇乙醇-水水-36%乙酸乙酸体系体系79第四章常用

29、书写字迹色料的薄层色谱分析第四章常用书写字迹色料的薄层色谱分析第一节薄层色谱分析法概述第二节对纯蓝墨水字迹的薄层色谱分析第三节对蓝黑墨水字迹的薄层色谱分析第四节对红墨水字迹的薄层色谱分析第五节对黑墨水字迹的薄层色谱分析第六节对碳素墨水字迹的薄层色谱分析第七节对签字笔字迹的薄层色谱分析第八节圆珠笔油墨的薄层层析分析第九节黑色签字笔十年发展变化研究第十节黑色笔迹与文件鉴定80分配层析之分配层析之反相硅胶层析反相硅胶层析u所谓反相是指用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。如在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，如甲醇和水的混合物。则被分离样品中的极性强的物质不被吸附

30、，最先洗下来，得到较好的分离效果。u以2040 m无定形硅胶（或球形硅胶）为载体，与十十八烷基三氯硅烷八烷基三氯硅烷进行键合制备出C18反相硅胶键合相（也称ODS柱），它可完成高效液相色谱7080的分析任务。此外还有C8、C4、苯基、氰基等。u流动相通常为甲醇/水体系或乙腈/水体系。81C18、C8、ODS、ODS2、RP18填料填料 u硅胶基质；高聚物小球基质；氧化铝；氧化锆uODS：Octadecyl silane，十八烷基硅烷u碳载量：色谱柱键全固定相的含碳量。一般碳载量高的，柱容量大，分离极性差异较小的比较好 u孔径、比表面积82ODS填料选择指南填料选择指南8384亲水基团疏水基团8

31、58687882.10.5 离子交换层析离子交换层析u离子交换剂是一种不溶性的高分子化合物，其分子（或其通过化学反应引进）具有解离性离子交换基团，当一定量的水溶液通过交换柱时，能与存在溶液中的阳离子或阴离子物质起交换作用，而这种交换是可逆的。u强（弱）酸型阳离子交换剂 SO3H，COOHu强（弱）碱型阴离子交换剂 N-(CH3)3X，NH2u亲水性离子交换剂（凝胶离子交换）可用于蛋白、多糖、生物碱的分离。89 RBCARACBMRSO HRSO MH33HXRN CHOHRN CHXH O()()33332去离子水是如何制得的？去离子水是如何制得的？90样品样品强酸型阳离子强酸型阳离子酸性、中

32、性化合物酸性、中性化合物强碱性阴离子强碱性阴离子中性化合物中性化合物吸附碱性化合物吸附碱性化合物及两性化合物及两性化合物稀NaOH洗脱酸性化合物酸性化合物912.10.6 凝胶层析和亲和层析凝胶层析和亲和层析u 亲和层析：亲和层析：是利用生物大分子之间有专一的亲和力专一的亲和力而达到分离纯化的层析方法优点优点：1.纯化过程简单、迅速纯化过程简单、迅速 2.分离效率高分离效率高 3.实验条件温和实验条件温和缺点缺点：1.针对某一分离对象就需要制备专一的针对某一分离对象就需要制备专一的 吸附剂和建立相应的实验条件吸附剂和建立相应的实验条件 2.配基的选择及其与基质的共价结合需配基的选择及其与基质的

33、共价结合需 要烦琐的操作步骤要烦琐的操作步骤9293具有专一性亲和力的生物分子对具有专一性亲和力的生物分子对：酶酶底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅 酶因子）酶因子）特异性抗原特异性抗原抗体抗体 激素激素受体受体 DNA互补的互补的DNA或或RNA 凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白94应具备的特性：应具备的特性：1.有丰富的可供活化的化学基团，并在温有丰富的可供活化的化学基团，并在温 和条件下能与配基共价结合。和条件下能与配基共价结合。2.惰性的，非专一性吸附无或足够小。惰性的，非专一性吸附无或足够小。3.多孔网状结构。多孔网状结构。4.良好的机械性能，具有好的液体流动性

34、。良好的机械性能，具有好的液体流动性。5.有较好的物理和化学稳定性。有较好的物理和化学稳定性。载体的选择载体的选择琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶95应具备的特性：应具备的特性：1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 2.必须具备能被修饰的功能基团必须具备能被修饰的功能基团固相化技术：固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于水的固相将配基以共价键连接于不溶于水的固相基质上制成固相化吸附剂基质上制成固相化吸附剂配基的选择配基的选择96亲和法举例亲和法举例亲和层析法分离豌豆凝集素u 原理原理 亲和层析技术利用豌豆凝集素可与葡聚

35、糖凝亲和层析技术利用豌豆凝集素可与葡聚糖凝胶发生特异性结合，再用含葡萄糖的氯化钠溶液将豌胶发生特异性结合，再用含葡萄糖的氯化钠溶液将豌豆凝集素洗脱下来。比较豌豆凝集素和杂蛋白对兔红豆凝集素洗脱下来。比较豌豆凝集素和杂蛋白对兔红细胞凝集作用的差异来进行鉴定。细胞凝集作用的差异来进行鉴定。器材器材 1.1.层析柱层析柱2.2.恒温孵育箱恒温孵育箱3.3.反应板反应板971 1）亲和层析分离）亲和层析分离 Sephadex G-50装柱，用1mol/L NaCl洗脱液平衡5分钟,加样6滴。加样后立即开始收集洗脱液，每管收集3ml，控制流速1015滴/分钟，待杂蛋白洗脱后，开始换0.2mol/L葡萄糖

36、NaCl洗脱液进行洗脱，每管收集3 ml。收集约10管后，用1mol/L NaCl洗脱液平衡柱5分钟，此柱即可再生。982 2）豌豆凝集素生物活性测定）豌豆凝集素生物活性测定 取反应板一块，分别在各孔中加入对照生理盐水、杂蛋白洗脱液、豌豆凝集素收集液各二滴再加入兔红细胞悬液1滴，置37保温10分钟，取出后用玻棒在反应孔轻轻搅动，比较各孔凝集情况，并解释结果。99各种层析分离原理及应用领域各种层析分离原理及应用领域层析分类层析分类分离原理分离原理应用领域应用领域吸附色谱吸附能、氢键各种有机化合物的分离、制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分

37、布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分离亲和色谱生化特异亲和力蛋白、抗体、酶分离，生物和医药分析手性色谱立体效应手性异构体分离、药物纯化100各种层析方法分离效能的比较各种层析方法分离效能的比较类型填充剂颗粒直径（um）N有效/t一般气相填充柱毛细管气相层析柱经典柱层析薄层层析不规则硅胶微粒层析柱多孔硅胶微球1300.20.5150755103610250.020.2211231012.10.7 2.10.7 气相色谱气相色谱 GCGC 惰性气体作为流动相，利用分配系数差异，组分在两相间多次（103-106）分配，由于固定相对组分保留能力不同，经过一定的柱长后彼此分离，顺序离开色谱柱进

38、入检测器，产生的信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。102103可替代可替代Porakak系列系列104105106107108109110111112113固定液的发展带动毛细管柱和气相色谱的发展固定液的发展带动毛细管柱和气相色谱的发展u十二烷基苯磺酸铝 u非高聚物，产品稳定u分离范围广,不但可分离弱极性的烷烃、芳烃、酯、酮,尤其对极性较强的有机羧酸有独特的分离能力,可不经衍生直接进样分析u耐老化114GC的优点的优点、高灵敏度：可检出10mg-10克的物质，可作超纯气体、高分子单体的痕迹量杂质分析和空气中微量毒物的分析。、高选择性：可有效地分离性质极为相近的各种同分异构体和各种同

39、位素。、高效能：可把组分复杂的样品分离成单组分。、速度快：一般分析、只需几分钟几十分钟即可完成。、应用范围广：即可分析低含量的气、液体，亦可分析高含量的气、液体，可不受组分含量的限制。、所需试样量少：一般气体样用几毫升，液体样用几微升或几十微升。、设备和操作比较简单仪器价格便宜。115 气相色谱仪气相色谱仪 gas chromatographic instruments岛津 GC2010 气相色谱仪116气相色谱结构流程气相色谱结构流程1-1-载气钢瓶；载气钢瓶；2-2-减压阀；减压阀；3-3-净化干燥管；净化干燥管；4-4-针形阀；针形阀；5-5-流量计流量计;6-;6-压力表；压力表；4-

40、4-针形阀；针形阀；5-5-流量计流量计;6-;6-压压力表；力表；9-9-热导检测器；热导检测器；10-10-放大放大器；器；11-11-温度控制器；温度控制器；12-12-记录仪；记录仪；载气系统载气系统进样系统进样系统色谱柱色谱柱检测系统检测系统温控系统温控系统117载气系统载气系统u作为气相色谱载气的气体，要求要化学稳定性好；纯作为气相色谱载气的气体，要求要化学稳定性好；纯度高；价格便宜并易取得；能适合于特定的检测器。度高；价格便宜并易取得；能适合于特定的检测器。u常用的载气有氢气、氮气、氩气、常用的载气有氢气、氮气、氩气、氦气氦气、二氧化碳气、二氧化碳气等等。等等。u载气为什么要净化

41、？应如何净化（净化器）？载气为什么要净化？应如何净化（净化器）？除去载气中的一些有机物、微量氧，水分等杂质除去载气中的一些有机物、微量氧，水分等杂质 不纯净的气体作载气，可导致柱失效，样品变化，不纯净的气体作载气，可导致柱失效，样品变化，氢焰色谱可导致基流噪音增大，热导色谱可导致鉴定氢焰色谱可导致基流噪音增大，热导色谱可导致鉴定器线性变劣等。一般均采用化学处理的方法除氧，如器线性变劣等。一般均采用化学处理的方法除氧，如用活性铜除氧；采用分子筛、活性碳等吸附剂除有机用活性铜除氧；采用分子筛、活性碳等吸附剂除有机杂质；采用硅胶，分子筛等吸附剂除水分。杂质；采用硅胶，分子筛等吸附剂除水分。118色谱

42、柱色谱柱(分离柱分离柱)色谱柱色谱柱:色谱仪的核心部色谱仪的核心部件。件。柱材质柱材质:不锈钢管或玻璃，不锈钢管或玻璃，内径内径3-63-6毫米。长度可根毫米。长度可根据需要确定。据需要确定。柱填料柱填料:粒度为粒度为60-8060-80或或80-10080-100目的色谱固定相。目的色谱固定相。119120u固定相：固定相：AT SE-30,AT OV-1组成：组成：100%甲基聚硅氧烷甲基聚硅氧烷极性：非极性极性：非极性应用：碳氢化合物应用：碳氢化合物同类型号：同类型号：DB(HP)-1、AC1、SPB-1、CPSIL5、DM-1、RT-1使用温度：使用温度：50300u固定相：固定相：A

43、T XE-60组成：组成：25%氰乙基甲基聚硅氧烷氰乙基甲基聚硅氧烷极性：中极性极性：中极性应用：酯、硝基化合物应用：酯、硝基化合物同类型号：同类型号：DB(HP)-225、AC225使用温度：使用温度：0280固定液使用固定液使用 121u固定相：固定相：AT FFAP组成：聚乙二醇组成：聚乙二醇TPA改性改性极性：极极性：极 性性应用：酸、醇、醛、酯、腈、酮、基油应用：酸、醇、醛、酯、腈、酮、基油同类型号：同类型号：DB(HP)FFAP、SP-1000、Supecl-NUKOL、AC20使用温度：使用温度：50250u固定相固定相:AT 农残农残号号AT 农残农残号号组成：组成：极性：极性

44、：应用：六六六、应用：六六六、DDT等含氯农药拟除虫菊酯类、含磷类农药等含氯农药拟除虫菊酯类、含磷类农药同类型号：同类型号：SPB-608、HP-608使用温度：使用温度：25300122123毛细管柱内径毛细管柱内径 u0.53mm 具有近似填充柱的负荷量，总柱效则远远超过填充柱具有近似填充柱的负荷量，总柱效则远远超过填充柱。达到同样的分离度时，。达到同样的分离度时，0.53mm大口径柱的分析时间显著快大口径柱的分析时间显著快于填充柱。可方便的采用柱上进样或直接进样技术，适合于分于填充柱。可方便的采用柱上进样或直接进样技术，适合于分析不太复杂的样品，是填充柱理想的替代柱。析不太复杂的样品，是

45、填充柱理想的替代柱。0.32mm 柱效稍低于柱效稍低于0.25mm常规柱，负荷量大于常规柱的常规柱，负荷量大于常规柱的60%，用特制注射针可做柱上进样。，用特制注射针可做柱上进样。0.25mm 最常用的内径规格。有较高的柱效，负荷量较低，必最常用的内径规格。有较高的柱效，负荷量较低，必须分流进样或无分流进样。用于复杂多组份样品分析。须分流进样或无分流进样。用于复杂多组份样品分析。0.20mm 柱效高柱效高,负荷量低，流失较小，适合与负荷量低，流失较小，适合与质谱质谱等灵敏检测等灵敏检测器联用。器联用。124毛细管柱长度毛细管柱长度 u512m 短柱：分离少于短柱：分离少于10个组份（不包含难分

46、离物个组份（不包含难分离物质对）的简单样品。质对）的简单样品。2530m 中长柱：分离中长柱：分离1050个组份的样品。个组份的样品。50m 长柱：分离大于长柱：分离大于50个组份或包含有难分离物质对个组份或包含有难分离物质对的复杂样品。的复杂样品。125膜膜 厚厚 u0.10.2um 薄液膜薄液膜低负荷量，高温下流失较小，适合于高沸点化合物的低负荷量，高温下流失较小，适合于高沸点化合物的分析，适于配高灵敏检测器。分析，适于配高灵敏检测器。0.250.33um 标准标准液厚液厚一般商品柱的标准液膜。一般商品柱的标准液膜。0.55.0um 厚液膜厚液膜较高的样品负荷量，在高温下流失较大，适于分析

47、低较高的样品负荷量，在高温下流失较大，适于分析低沸点样品。沸点样品。126检测器检测器127u热导池检测器的检测原理是基于不同组分与载气之间有不同的热导系数。u当经色谱柱分离后的组份被载气带入热导池中由于组份和载气的热传导率不同，因而使热敏元件温度发生变化，并导致电阻发生变化导致电阻发生变化，从而导致电桥不平衡，输出电压信号，此信号的大小与被测组份的浓度成函信号的大小与被测组份的浓度成函数关系数关系，再由记录仪或色谱数据处理机进行换算并记录下来。热导池检测器的工作原理（热导池检测器的工作原理（TCD）128热敏电阻丝R参热敏电阻丝R测载气+组份参比池测量池纯载气构造灵敏度低灵敏度低（不小于（不

48、小于3000mvml/mg）常用于填充柱和浓度较大时常用于填充柱和浓度较大时129氢焰电离检测器的工作原理（氢焰电离检测器的工作原理（FID）目前认为火焰中的电离不是热电离而是化学电离，即有机目前认为火焰中的电离不是热电离而是化学电离，即有机物在火焰中发生自由基反应而被电离。物在火焰中发生自由基反应而被电离。化学电离产生的正离子化学电离产生的正离子(CHO+、H3O+)和电子和电子(e)在外加在外加150300v直流电场作用下向两极移动而产生微电流。经放大后，直流电场作用下向两极移动而产生微电流。经放大后，记录下色谱峰。记录下色谱峰。氢火焰电离检测器对大多数的有机化合物有很高的灵敏度。氢火焰电

49、离检测器对大多数的有机化合物有很高的灵敏度。但对在氢火焰中不电离的无机化合物例如但对在氢火焰中不电离的无机化合物例如CO、CO2、SO2、N2、NH3等和电离差的有机化合物等和电离差的有机化合物CCl4则不能检测。则不能检测。130气相色谱为什么常要进行程序升温？气相色谱为什么常要进行程序升温？u提高柱温可以提高传质速率，提高柱效，但柱温过高提高柱温可以提高传质速率，提高柱效，但柱温过高又会使组分间分离度减小。又会使组分间分离度减小。u柱温的变化影响柱的选择性和柱效。柱温的变化影响柱的选择性和柱效。u宽沸程混合物，选用程序升温法宽沸程混合物，选用程序升温法u可以通过升温控制物质分离效果，例如维

50、持低温使易可以通过升温控制物质分离效果，例如维持低温使易挥发物先进入柱子，再逐渐升温使难挥发物进入柱子挥发物先进入柱子，再逐渐升温使难挥发物进入柱子，从而达到两类物质的有效分离。，从而达到两类物质的有效分离。131132为什么要对气相色谱柱进行为什么要对气相色谱柱进行“老化老化”？u目的有两个，一是为了彻底除去填充物中的残余溶剂（包括水目的有两个，一是为了彻底除去填充物中的残余溶剂（包括水），和某些挥发性杂质。二是促进固定液均匀的、牢固分布在），和某些挥发性杂质。二是促进固定液均匀的、牢固分布在担体的表面上担体的表面上u一般一段时间不用柱子，再用时，均要对柱子进行老化，根据一般一段时间不用柱子

51、，再用时，均要对柱子进行老化，根据个人习惯和需要老化个人习惯和需要老化224h（一般（一般20h，极性长，极性长/非极性短）。非极性短）。u频繁老化柱子，对柱子寿命有影响。频繁老化柱子，对柱子寿命有影响。133气相色谱检测中样品的衍生化有何目的？气相色谱检测中样品的衍生化有何目的？u举例：脂肪酸衍生化：高沸点脂水解或皂化，然后脂肪酸或脂肪酸盐再与甲醇或乙醇反应u降低沸点降低沸点u增加高温稳定性增加高温稳定性u减少损失和保留减少损失和保留134气相色谱我们还必须掌握的细节气相色谱我们还必须掌握的细节u载气为什么要净化？u稳压阀用途？u先通载气还是先加热柱子？u混合气体平均沸点和进样汽化温度控制？

52、u气相色谱仪要放置在通风环境？u135Agilent 7890A/5975C 气质联用仪 谱库：NIST05标准谱库19万张，化学结构式库：16万张 136裂解气相色谱红外光谱联用仪 裂解器：PYROJECTOR II气相色谱：Agilent 6890 红外光谱：Nicolet5700 澳大利亚 SGE公司美国安捷伦公司美国热电公司 137气相色谱在挥发油成分分析中的应用气相色谱在挥发油成分分析中的应用138挥发油含量检测挥发油含量检测139挥发油指纹图谱建立挥发油指纹图谱建立140141气质联用鉴定玛咖挥发油中的主要成分气质联用鉴定玛咖挥发油中的主要成分142143 144高效液相色谱法高效

53、液相色谱法145高效液相色谱最典型的特征：高效液相色谱最典型的特征：使用内径使用内径28mm的细口径不锈钢色谱柱的细口径不锈钢色谱柱，平均直径小于，平均直径小于50um的各类型填充颗粒均匀的各类型填充颗粒均匀填充，使分离效率提高；采用很高的入口压力填充，使分离效率提高；采用很高的入口压力（150400大气压），使流动相的速度增高，大气压），使流动相的速度增高，线速度一般在线速度一般在0.15cm/s(0.01100ml/min)之之间，甚至更高一些；并通过各种高灵敏度的检间，甚至更高一些；并通过各种高灵敏度的检测器在线检测（紫外检测器可达测器在线检测（紫外检测器可达0.01ng），以），以达到

54、高速高效分离分析或制备纯化各种化合物达到高速高效分离分析或制备纯化各种化合物的液相柱层析方法。的液相柱层析方法。146HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：与经典液相色谱相比有以下优点：u速度快通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。u分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。u灵敏度高紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。u色谱柱可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物。u样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分。147进样口检测器色谱图色谱柱溶剂泵混合器148149150Waters ACQUITY UPLC

55、系统系统151高效液相的基本操作步骤高效液相的基本操作步骤u1.过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。u2.对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟(250ml)。u3.打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。u4.进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。152u5.有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。u6.调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过200bar。选用合适的流速和所需波长，走基线，观察基线的情况u7.进样和进样后操作。进样，所有的样品均需过滤；全部样品内成分在流

56、动相下出峰后，继续走一段基线，用10%甲醇和纯甲醇分别洗掉柱内杂质。u8 关机时，先关计算机，再关液相色谱。u9.登记。153气相色谱气相色谱 PK 高效液相色谱高效液相色谱1.分子量应用范围：气相分子量应用范围：气相11001000；液相；液相1005000100002.2.几乎所有不能用气相分析的样品；以及气相可以分析的部分样品几乎所有不能用气相分析的样品；以及气相可以分析的部分样品3.3.液相色谱流动相多样，可以通过选择流动相和固定相使样品得到液相色谱流动相多样，可以通过选择流动相和固定相使样品得到良好的分离良好的分离4.4.比气相更方便制备，尤其是那些热敏的活性物质比气相更方便制备，尤

57、其是那些热敏的活性物质1.液相条件的摸索比较复杂液相条件的摸索比较复杂2.2.液相所需流动相比较贵，而且也不环保液相所需流动相比较贵，而且也不环保3.3.高效液相色谱价格较贵，操作要更加规范，技术要求更高高效液相色谱价格较贵，操作要更加规范，技术要求更高154高效液相色谱的家当高效液相色谱的家当1、过滤时为什么滤膜光面向上？2、HPLC中滤膜的选择155u亲水性样品：选用亲水膜片，对水有亲和力，适合过滤水为基质的溶液。可用的滤膜有：混合纤维素酯（MCE）、聚醚砜（PES）、亲水PVDF(聚偏氟乙烯）、亲水PTFE（聚四氟乙烯）、尼龙66等。u强腐蚀性有机溶剂：一般采用疏水性膜，如PTFE、聚丙

58、烯（PP）等材质的滤膜。u蛋白溶液：低蛋白吸附的滤膜，如PVDF滤膜。u离子色谱：通常认为PES滤膜比较适合低无机离子的溶液的过滤。156u如果选择针式过滤器，还要考虑样品的体积u通常样品量小于2ml时，选用4mm直径的微型过滤器；u样品量在2-10ml之间，选用13mm直径的过滤器；u当样品量大于10ml时，选用25mm直径的针式过滤器。u不要使用小于10 cc的注射器，因为小体积柱管可能会使压力超过上限，导致滤膜的破坏或者人身伤害。u仅限于实验室专用,一次性使用，不可再生。u应弃去部分开头的滤液，体积约为过滤器的死体积，以25 mm为例，大概弃去前1ml滤液；或者用1 至2 ml的溶液预清

59、洗过滤器。157通用型在线脱气机 蓝盖瓶 HPLC专用 超声波清洗器 158针头过滤器159160161自动进样自动进样100100样品盘样品盘/机器手机器手/自动洗针自动洗针机械手样品盘162琳琅满目的液相色谱柱，我们如何选择？琳琅满目的液相色谱柱，我们如何选择？分析还是制备？分析还是制备？极性如何？极性如何？样品数量？样品数量？分离难度？分离难度？重现性要求？重现性要求？pH值要求如何？值要求如何？有无前人的经验？有无前人的经验？口袋里面的钱有多少？口袋里面的钱有多少？163类型性质色谱分离方式烷基烷基C8、C4非极性非极性反相、离子对反相、离子对烷基烷基C18非极性非极性反相、离子对反相

60、、离子对苯基苯基非极性非极性反相反相芳硝基芳硝基弱极性弱极性反相或正相反相或正相氰基氰基极性极性正相（反相）正相（反相）氨基氨基极性极性正相（反相、阴离子交换）正相（反相、阴离子交换）164Protein-Pak TM高分辨离子交换柱高分辨离子交换柱Protein-PakTM HR离子交换柱:填料:刚性亲水性的聚甲基丙烯酸酯孔径:1000（100纳米，0.1m）优点:非特异性吸附小，扩散小165166HPAEu高效阴离子交换色谱测定蜂蜜中葡萄糖和果糖的研究高效阴离子交换色谱测定蜂蜜中葡萄糖和果糖的研究uCarboPacTM PAl0(4mm250mm)阴离子交换分离柱u脉冲安培检测器：电解池内

61、有电解反应的发生u选择18mmol/L NaOH为淋洗液u单糖在碱性条件下阴离子化单糖在碱性条件下阴离子化异构化(烯醇化反应)u流速1.0mL/minu总时间20minu能较好地分离葡萄糖、果糖和蔗糖。天然蜂蜜中蔗糖含量非常少，利用此方法可以鉴别天然蜂蜜的真伪。167分析柱、半制备柱、制备柱流速转化分析柱、半制备柱、制备柱流速转化uspeed=制备柱内(半)径的平方/分析柱内(半)径的平方1分析柱填料的粒径/制备柱填料的粒径1.5*1.5/0.23*0.23*1ml/min*5um/10um=21.2ml/min168柱温箱色谱试剂169170让人流口水的一台让人流口水的一台HPLC高效液相色

62、谱仪高效液相色谱仪-配备三个检测器，分别是紫外检测器、电导检测器、示差折光检测器。此外有二极管阵列检测器、荧光检测器、电化学检测器、蒸发激光散射检测器171u紫外检测器是紫外检测器是高压液相色谱仪常用的一种检测器。利用试样组分吸收紫外线，依据紫外线吸收光谱进行分析。有两种类型的紫外检测器，一是固定波长（254nm）紫外检测器，一是可变波长紫外检测器。用这种检测器时，流动相必须在所使用的波长处无吸收流动相必须在所使用的波长处无吸收。紫外检测器主要用于检测芳烃，含共轭双键和生色检测芳烃，含共轭双键和生色团的试样组分团的试样组分。由于结构简单、操作方便、灵敏度高（10-9g/ml），且不受温度、流量

63、等因素的影响，并能用于梯度洗脱，因而在液相色谱中被广泛采用。是是HPLC的主要耗材之一，有时间限制！的主要耗材之一，有时间限制！价格较贵！价格较贵！172PDA 二极管阵列检测器二极管阵列检测器 u光电二极管阵列检测器(Photo-Diode Array)检测器或DAD(Diode Array Detector)检测器，上世纪80年代发展起来的新型紫外检测器。u紫外检测器只能用单波长检测,而二极管能同时进行全波长检测。也就是说紫外检测器的谱图是二维的,而二极管检测器的谱图是三维的。u分析物质中有多个化合物共存，且紫外特征差异较大，PDA就更有优势。173174175示差检测器示差检测器 u示差

64、检测器是连续检测样品流路与参比流路间液体折光指数差值的检测器，是根据折射原理设计的u示差折光检测器对高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等都能够检测。在凝胶色谱中示差折光检测器是必不可少的。另外在制备色谱中也经常用到。还适用于流动相紫外吸收本底大，不适于紫外吸收检测的体系。u示差检测器属于通用性检测器，如果选择合适的溶剂，几乎所有的物质都可以进行检测。u不能用于梯度洗脱，灵敏度低，检测限1mg/ml0.1mg/ml 176u电导检测器（electrolytic conductivity detector,ELCD）：基于离子性物质的溶液具有导电性，其电导率与离子的性质和浓度相关。电导检测器是离子色谱中

65、必备的检测器。u荧光检测器（fluorescence detector，FD）：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。有的有机化合物可与发荧光物质反应衍生化后检测。灵敏度要比紫外检测法高2-3个数量级。所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析。177蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detector,ELSD）u色谱柱流出液导入雾化器，被载气色谱柱流出液导入雾化器，被载气雾化成微细液滴，液滴通过加热漂雾化成微细液滴，液滴通过加

66、热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信射光并通过光电倍增管转变成电信号。号。u因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。178179进样器高压泵流动相色谱柱检测器数据处理180何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？同之处？在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成或浓度配比，称为梯度洗提是改进液相色谱分离的重要手段 梯度洗提与气相色谱中的程序升温类似，但是前者连续改变的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度。程序升温也是改进气相色谱分离的重要手段181柱子柱压高，被污染了怎么办？柱子柱压高，被污染了怎么办？1、清洗（依据柱子的耐受程度）：甲醇、乙腈、5%甲醇、水、25%异丙醇异丙醇-