基因制备与克隆策略管理知识分析

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1、Princple and Technology of Genetic Engineering基因工程原理基因工程原理Professor,Dr.Degang Zhao(赵德刚赵德刚)Guizhou Key Laboratory of Agricultural Bioengineering,College of Life Sciences,Guizhou University E-mail: 1第五章第五章 基因工程工具酶基因工程工具酶 The Tool of the Gene Engineering 教学目的与要求：教学目的与要求：1）掌握掌握II型限制性核酸内切酶的切割原理，和型限制性核酸内切

2、酶的切割原理，和部分常用识别位点。部分常用识别位点。2）掌握常作掌握常作DNA聚合酶的特性和用途。聚合酶的特性和用途。3）了解了解DNA连接酶和修饰酶在基因操作中的连接酶和修饰酶在基因操作中的用途。用途。2第一节第一节 目的基因的制备目的基因的制备 3目的基因（目的基因（Target Gene）：指基因工程中需要进行制备、克隆：指基因工程中需要进行制备、克隆或利用的基因。或利用的基因。制备目的基因要根据需要获得制备目的基因要根据需要获得DNA片段，可能是启动子、终止片段，可能是启动子、终止子、内含子，或者是编码某种蛋白完整的序列。子、内含子，或者是编码某种蛋白完整的序列。目的基因制备方法有直接

3、分离法、基因文库筛选法、目的基因制备方法有直接分离法、基因文库筛选法、PCR扩增扩增法以及化学合成法等。法以及化学合成法等。一、目的基因的直接分离法一、目的基因的直接分离法1限制性核酸内切酶酶切分离法限制性核酸内切酶酶切分离法这是最简单的获取目的基因的方法，主要是从质粒、病毒等比这是最简单的获取目的基因的方法，主要是从质粒、病毒等比较简单的较简单的DNA分子或基因组中分离目的基因。无论是已知序列分子或基因组中分离目的基因。无论是已知序列或是尚未测序的序列都可进行分离，只要确定目的基因两侧的或是尚未测序的序列都可进行分离，只要确定目的基因两侧的酶切位点，就可用相应的酶进行切割，获得目的基因。酶切

4、位点，就可用相应的酶进行切割，获得目的基因。42.基因分离的物理化学法基因分离的物理化学法其原理是根据基因的其原理是根据基因的DNA分子两条链分子两条链GC含量差异较大，理化性含量差异较大，理化性质、包括浮力密度和解链温度明显不同所采用相应的方法进行分质、包括浮力密度和解链温度明显不同所采用相应的方法进行分离。离。（1）密度梯度离心法）密度梯度离心法 将将DNA切割成适当片段，富含切割成适当片段，富含GC的双链的双链DNA片段浮力密度大，利用密度梯度超速离心技术，可将片段浮力密度大，利用密度梯度超速离心技术，可将DNA片段按不同密度大小分开。片段按不同密度大小分开。（2）单链酶解法）单链酶解法

5、 基因基因GC含量高（三个氢键），含量高（三个氢键），Tm值高，热稳值高，热稳定性高，可通过控制解链温度使富含定性高，可通过控制解链温度使富含A=T区变性解链，区变性解链，GC区维区维持双链状态，再利用单链核酸酶持双链状态，再利用单链核酸酶S1酶切单链部分，获得富含酶切单链部分，获得富含GC的基因片段。的基因片段。（3）分子杂交法）分子杂交法 利用利用DNA单链易与互补链形成双链的原理，单链易与互补链形成双链的原理，将已知基因将已知基因DNA与目的生物的与目的生物的DNA进行复性，再用单链核酸酶进行复性，再用单链核酸酶S1酶切除单链，留下的双链即为目的基因序列酶切除单链，留下的双链即为目的基因

6、序列53.双抗体免疫法分离编码蛋白基因双抗体免疫法分离编码蛋白基因 基因翻译过程中，核糖体沿基因翻译过程中，核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体。利用多肽链制备的抗体及二抗，与多聚核糖核核糖核蛋白体。利用多肽链制备的抗体及二抗，与多聚核糖核蛋白体一起温育，目的基因的多聚核糖核蛋白体将通过抗原抗蛋白体一起温育，目的基因的多聚核糖核蛋白体将通过抗原抗体反应与相应抗体形成复合物，利用不连续蔗糖梯度离心将此体反应与相应抗体形成复合物，利用不连续蔗糖梯度离心将此复合物分离出来，再通过酚复合物分离出来，再通过酚/仿抽提法出去蛋白质部分，过仿抽提法出去蛋白质部分，过o

7、ligo-dT柱层析，即可分离出特定蛋白编码的柱层析，即可分离出特定蛋白编码的mRNA，反转录，反转录即可得到即可得到cDNA。目前，可用金黄色葡萄球菌中分离的。目前，可用金黄色葡萄球菌中分离的protein A代替二抗，再用代替二抗，再用protein A-Sepharose 4B 作亲和层析，分离作亲和层析，分离出特定的多聚核糖体（代替密度梯度离心）。出特定的多聚核糖体（代替密度梯度离心）。64利用酶促反转录直接从特定利用酶促反转录直接从特定mRNA分离基因分离基因 此法是在目的基因的此法是在目的基因的mRNA占细胞中总占细胞中总mRNA量很大时采量很大时采用，直接用逆转录酶合成用，直接用

8、逆转录酶合成cDNA，与载体重组后导入受体菌扩，与载体重组后导入受体菌扩增，获得目的基因的增，获得目的基因的cDNA克隆。如哺乳动物的网织红细胞中克隆。如哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白珠蛋白mRNA占总占总mRNA的的90%以上，用此法克隆了该基因。以上，用此法克隆了该基因。75构建基因文库分离目的基因构建基因文库分离目的基因 基因文库分基因组文库和基因文库分基因组文库和cDNA文库。基因文库可用质粒载体、文库。基因文库可用质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒（噬菌体载体、柯斯质粒（cosmid）载体和酵母人工染色体）载体和酵母人工染色体（YAC）载体进行构建。）载体进行构建。从基因组文库可以分离获得

9、基因编码序列、调控序列、启动子、从基因组文库可以分离获得基因编码序列、调控序列、启动子、终止子、核糖体识别终止子、核糖体识别mRNA序列、序列、ARS、端粒序列、间隔序列、端粒序列、间隔序列等，可用于基因结构分析、基因表达和调控研究等。等，可用于基因结构分析、基因表达和调控研究等。cDNA文库来自于模板文库来自于模板mRNA的核苷酸序列，只能反映基因表的核苷酸序列，只能反映基因表达的转录及加工后达的转录及加工后mRNA产物所携带的信息，所以从产物所携带的信息，所以从cDNA文文库可以分离到基因的编码序列。库可以分离到基因的编码序列。8筛选基因文库的方法：筛选基因文库的方法：已知基因序列，可以人

10、工合成核酸探针，通过核酸杂交，从已知基因序列，可以人工合成核酸探针，通过核酸杂交，从基因文库中筛选出含目的基因的克隆。基因文库中筛选出含目的基因的克隆。已分离纯化某蛋白，并知其氨基酸序列，根据氨基酸序列合已分离纯化某蛋白，并知其氨基酸序列，根据氨基酸序列合成寡聚核苷酸序列作为探针，筛选基因文库。成寡聚核苷酸序列作为探针，筛选基因文库。已纯化某蛋白，未能测出其氨基酸序列，可以该蛋白制备抗已纯化某蛋白，未能测出其氨基酸序列，可以该蛋白制备抗体，从体，从cDNA表达文库中筛选出含该蛋白编码基因的克隆。表达文库中筛选出含该蛋白编码基因的克隆。对编码产物未知的基因，采用特殊分离方法如差别显示技术、对编码

11、产物未知的基因，采用特殊分离方法如差别显示技术、差减杂交法、遗传互补法等。差减杂交法、遗传互补法等。9遗传互补法（功能互补法）原理：遗传互补法（功能互补法）原理：当把一外源当把一外源DNA片段引入一片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因。必备条件：外源基因不仅能在携带着决定新性状的遗传基因。必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。营养缺陷型受体细胞营养缺陷型受体细胞+外源外源DNA 转化细胞涂布在合成培养基转化细胞涂布在合成培养

12、基上上 原养型细胞生长原养型细胞生长受体细胞（无某种表型）受体细胞（无某种表型）+外源外源DNA 转化细胞涂布在特殊转化细胞涂布在特殊培养基上培养基上 具有新性状细胞具有新性状细胞虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转入目的基因后，虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，这亦可用于基因筛选。如酿酒酵该细胞可过量产生此酶活性，这亦可用于基因筛选。如酿酒酵母的母的MF基因就是如此筛选到的。基因就是如此筛选到的。实例：基因组文库实例：基因组文库DNA 转化酿酒酵母细胞（转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）转化细胞（转化细胞（leu2/LEU2，Leu+

13、）LEU2基因基因基因组文库基因组文库DNA 转化转化E.coli（无纤维素酶活性）（无纤维素酶活性）转化细胞转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈可在纤维素平板上形成水解圈 纤维素酶基因纤维素酶基因10核酸杂交法（同源序列克隆法）：核酸杂交法（同源序列克隆法）：（1)原理原理 利用核酸探针与待分离利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交的同源序列可进行杂交的特点分离目的基因。（的特点分离目的基因。（2)核酸探针种类核酸探针种类 DNA探针探针:分离分离自某一种生物。自某一种生物。寡核苷酸探针寡核苷酸探针:根据目的基因编码蛋白质的根据目的基因编码蛋白质的部分氨基酸序列推测，人工化学合成。部分

14、氨基酸序列推测，人工化学合成。如：如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala 六肽六肽 QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN 对应对应mRNA N：ACGT/U CAN-AAP-GTP-CTP-CG 探针序列探针序列 Q：CT/U P：AG32种种14聚体的混合物，其中必有一种与待测聚体的混合物，其中必有一种与待测DNA完全互补。完全互补。cDNA探针探针:利用特异性利用特异性 mRNA反转录而成，亦可用不同反转录而成，亦可用不同mRNA 混混合物反转录而成。合物反转录而成。RNA探针探针:由由T3或或T7启动子和相应聚合酶转录其下游基因片段而得。启动子和相应聚合酶转录其下游

15、基因片段而得。11分离步骤：基因文库分离步骤：基因文库 制备制备DNA样品膜样品膜与标记探针杂交与标记探针杂交 杂交斑点（阳性克隆）杂交斑点（阳性克隆）分离重组分离重组DNA分子分子 作斑点和作斑点和Southern杂交以确认杂交结果杂交以确认杂交结果 DNA进一步证实和鉴定：核进一步证实和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；分离插入片段进行基因酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；分离插入片段进行基因表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物。表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物。6特异性特异性DNA片段片段(基因基因)的的PCR扩增扩增 124目的基因的化学合成法目的基因的化学合成法（1）

16、核酸片段化学合成）核酸片段化学合成 有磷酸二酯法、磷酸三酯法和亚磷酸三酯法，反应体系有液相有磷酸二酯法、磷酸三酯法和亚磷酸三酯法，反应体系有液相和固相。目前常用的方法是固相亚磷酸三酯法。第一个核苷酸和固相。目前常用的方法是固相亚磷酸三酯法。第一个核苷酸的的3端通过端通过3羟基与惰性固相载体上的间隔臂形成酯健，寡核苷羟基与惰性固相载体上的间隔臂形成酯健，寡核苷酸按酸按3-5方向进行化学合成，正常终产物是方向进行化学合成，正常终产物是3、5端均带有羟端均带有羟基的寡聚核苷酸。基的寡聚核苷酸。合成原料：经化学修饰的核苷合成原料：经化学修饰的核苷亚磷酰胺。有两种类型：亚磷酰胺。有两种类型：甲甲基化亚磷

17、酰胺；基化亚磷酰胺；-氰乙基氰乙基-亚磷酰胺。合成时要对羟基、磷酸、亚磷酰胺。合成时要对羟基、磷酸、氨基进行保护，合成结束后，去掉所有保护基团。氨基进行保护，合成结束后，去掉所有保护基团。固相载体：是对固相载体：是对DNA合成试剂惰性的物质，目前采用可控孔径合成试剂惰性的物质，目前采用可控孔径的玻璃沙（的玻璃沙（CPG）,其表面的硅氧烷键可与其表面的硅氧烷键可与A、G、C、T核苷的核苷的3-羟基以酯键连接，该键可用羟基以酯键连接，该键可用29%浓氨水打断。浓氨水打断。13反应分四步：反应分四步：1）二甲氧三苯甲基（二甲氧三苯甲基（DMT，羟基保护基团）的脱除，羟基保护基团）的脱除 用三氯乙酸用

18、三氯乙酸（TCA）或二氯乙酸（）或二氯乙酸（DCA）处理，脱去连在固相载体上的核苷）处理，脱去连在固相载体上的核苷酸或寡核苷酸酸或寡核苷酸5羟基的羟基的DMT保护基团。保护基团。2）偶联反应（缩合反应，加成反应）偶联反应（缩合反应，加成反应）由溶于无水乙腈中的四唑催化，由溶于无水乙腈中的四唑催化，使亚磷酰胺单体的使亚磷酰胺单体的3磷酸基团与固相载体上的磷酸基团与固相载体上的5羟基发生反应，羟基发生反应，形成亚磷酸三酯键。形成亚磷酸三酯键。3）封闭反应）封闭反应 加成反应剩下的亚磷酰胺，以加成反应剩下的亚磷酰胺，以N-甲基眯唑催化，用乙甲基眯唑催化，用乙酸酐使羟基乙酰化，封闭其羟基，防止在下一循

19、环中发生加成反酸酐使羟基乙酰化，封闭其羟基，防止在下一循环中发生加成反应。应。4）氧化反应）氧化反应 在碱性条件下，以碘使加成反应形成的在碱性条件下，以碘使加成反应形成的3，5亚磷酸三亚磷酸三酯键氧化为稳定的酯键氧化为稳定的5价磷酸三酯。价磷酸三酯。上述每循环一次，增加一个核苷酸，需上述每循环一次，增加一个核苷酸，需79min。每一步反应完成都。每一步反应完成都以乙腈清洗，氩气吹干，保证无水环境。合成反应结束后，除去以乙腈清洗，氩气吹干，保证无水环境。合成反应结束后，除去保护基团，保护基团，29%浓氨水处理使寡聚核苷酸从载体上释放出来，乙浓氨水处理使寡聚核苷酸从载体上释放出来，乙醇或异丙醇沉淀

20、、回收醇或异丙醇沉淀、回收DNA。用用RNA亚磷酸胺单体和聚苯乙烯固相载体，合成亚磷酸胺单体和聚苯乙烯固相载体，合成RNA。14（2）化学合成）化学合成DNA片段种类片段种类 DNA互补链合成引物互补链合成引物 包括包括PCR引物和测序引物。引物和测序引物。DNA Linker 预先设计，通过化学合成的寡聚核苷酸片段，预先设计，通过化学合成的寡聚核苷酸片段，含有含有1种或几种酶切位点，酶切可产生粘性末端。如果将含种或几种酶切位点，酶切可产生粘性末端。如果将含有多个酶切位点的有多个酶切位点的Linker 引入克隆载体中，就会形成多克隆引入克隆载体中，就会形成多克隆位点（位点（MCS），这种具有多

21、克隆位点的连杆称），这种具有多克隆位点的连杆称MCS Linker。Adaptor 是一种化学合成的寡聚核苷酸，含有一种以上的是一种化学合成的寡聚核苷酸，含有一种以上的内切酶位点。其与内切酶位点。其与Linker的差别是的差别是Adaptor一端或两端已有一端或两端已有1种或两种内切酶切割产生的粘性末端。种或两种内切酶切割产生的粘性末端。DNA 芯片芯片指指DNA片段以事先设计的排列方式固定在片段以事先设计的排列方式固定在载波片或尼龙膜上组成的密集分子排列。固定的是探针，或载波片或尼龙膜上组成的密集分子排列。固定的是探针，或者是靶者是靶DNA分子。分子。15（3）目的基因的化学合成法）目的基因

22、的化学合成法1979年，年，Khorana等首次化学合成基因有生物活性。有全片段等首次化学合成基因有生物活性。有全片段酶促连接法和酶促填充法。酶促连接法和酶促填充法。165利用表达序列克隆目的基因利用表达序列克隆目的基因（1）表达序列标签法分离目的基因）表达序列标签法分离目的基因Expressed sequence tag，简称，简称EST：指基因序列中一段能特异地标记：指基因序列中一段能特异地标记或表征基因的序列，通常它含有足够的结构信息以显示出该基因与其他基或表征基因的序列，通常它含有足够的结构信息以显示出该基因与其他基因的差异，长度一般为因的差异，长度一般为100500 bp。利用。利用

23、EST寻找新基因的策略即为表寻找新基因的策略即为表达序列标签法（达序列标签法（ESTs）。最早由）。最早由M.D.Adam在在1991年建立并加以应用，年建立并加以应用，有的文献称之为有的文献称之为 cDNA测序法。测序法。基本步骤如下：基本步骤如下：从组织特异性或细胞特异性的从组织特异性或细胞特异性的cDNA文库中随机挑选文库中随机挑选克隆，进行克隆，进行5端和端和3端部分序列（约端部分序列（约400 bp）的测定。）的测定。通过对通过对GenBank、EMBL或其他核苷酸序列数据库进行联机检索，可以检测出或其他核苷酸序列数据库进行联机检索，可以检测出所测定序列及其对应的多肽氨基酸序列。将检

24、测的序列与基因库中已知基所测定序列及其对应的多肽氨基酸序列。将检测的序列与基因库中已知基因进行同源比较，可检测到已知基因和未知基因。因进行同源比较，可检测到已知基因和未知基因。通过基因文库的筛通过基因文库的筛选或基因定位的方法分离目的基因。选或基因定位的方法分离目的基因。表达序列标签法分离目的基因有时可以从几个不同基因的高度保守区得到表达序列标签法分离目的基因有时可以从几个不同基因的高度保守区得到相同的相同的cDNA片断，有时一个较大的基因不同外显子又能表现为若干不同片断，有时一个较大的基因不同外显子又能表现为若干不同的的cDNA。17（2）计算机克隆）计算机克隆(silicon clonin

25、g)或生物信息学或生物信息学(bioinformatics)克隆新基因策略克隆新基因策略生物信息学克隆新基因策略是表达序列标签法的延伸和发展。生物信息学克隆新基因策略是表达序列标签法的延伸和发展。生物信息学与计算机科学、信息学等学科相互交叉而诞生的一生物信息学与计算机科学、信息学等学科相互交叉而诞生的一门新兴学科，核心内容是通过对生物学实验数据的获取、加工、门新兴学科，核心内容是通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，进而达到揭示数据所蕴含的生物学意义的存储、检索与分析，进而达到揭示数据所蕴含的生物学意义的目的。目的。做法：做法：利用已发现的其他物种基因的利用已发现的其他物种基因的

26、cDNA序列为参照，在国序列为参照，在国际互联网的际互联网的EST数据库（数据库（GebBank或或EMBL等）中进行同源搜等）中进行同源搜索，获得一系列同源的或部分重叠的索，获得一系列同源的或部分重叠的EST 序列，然后用序列，然后用GCG、DNAstar 软件中的软件中的alignment 程序将它们拼接成一个程序将它们拼接成一个EST 重叠重叠群群(contig)，经过逐步延伸（，经过逐步延伸（cDNA salking)及整合后可获得全及整合后可获得全长的长的cDNA 序列；根据该推测的序列，可合成相应的特异引物，序列；根据该推测的序列，可合成相应的特异引物，进行进行PCR 扩增后，即可

27、获得该基因的扩增后，即可获得该基因的cDNA片断。片断。局限性：局限性：难以寻找到一些表达量极低或者不表达的新基因类型，难以寻找到一些表达量极低或者不表达的新基因类型，克隆基因的功能也有待鉴定。克隆基因的功能也有待鉴定。18（3）基因表达系列分析法）基因表达系列分析法基因表达系列分析法基因表达系列分析法(serial analysis of gene expression,简简称称SAGE)可一次对大量基因转录产物进行定量分析，从中找出可一次对大量基因转录产物进行定量分析，从中找出新的基因。新的基因。原理原理（两个）：（两个）：从转录物某一特定位置上分离得到一段从转录物某一特定位置上分离得到一

28、段910bp 的寡核苷酸序列标签的寡核苷酸序列标签(sequence tag,ST)，它含有确定，它含有确定的一个独特转录物的足够信息量，可代表此转录物的特异性。的一个独特转录物的足够信息量，可代表此转录物的特异性。理论上随机排列的理论上随机排列的9bp片断可区分片断可区分262 144（4 9）种转录物，）种转录物，人类的基因约仅有人类的基因约仅有80 000个转录子，因此，个转录子，因此，9个核苷酸序列可以个核苷酸序列可以代表所有转录子的特征。代表所有转录子的特征。多个序列标签（多个序列标签（ST）能以锚定酶）能以锚定酶(anchoring enzyme,AE，识别位点为，识别位点为4碱基

29、的限制性核酸内切碱基的限制性核酸内切酶酶)识别位点序列相隔相互连成双标签序列识别位点序列相隔相互连成双标签序列(ditag)的多联体，将的多联体，将该多联体序列克隆到一个载体中，用连续的方法进行多联体序该多联体序列克隆到一个载体中，用连续的方法进行多联体序列分析，再通过计算机处理，确定每一种序列（列分析，再通过计算机处理，确定每一种序列（ST）代表转录）代表转录产物的种类和出现频率，由此实现对转录物的高效、快速和大产物的种类和出现频率，由此实现对转录物的高效、快速和大量的分析。量的分析。19 6筛选目的基因片断的差别杂交及减法杂交技术筛选目的基因片断的差别杂交及减法杂交技术（1）差别杂交法）差

30、别杂交法差别杂交（差别杂交（differential hybridization）或称为差别筛选）或称为差别筛选(differential screening)法，法，特别适用于分离在特定组织中、发育的特定阶段表达的基因以及受生长因子调节的特别适用于分离在特定组织中、发育的特定阶段表达的基因以及受生长因子调节的基因，亦可有效地用来分离经特殊处理诱导表达的基因。基因，亦可有效地用来分离经特殊处理诱导表达的基因。方法是分别制备两种不同细胞群体的方法是分别制备两种不同细胞群体的mRNA 提取物，其中一个群体含有一定比例的提取物，其中一个群体含有一定比例的目的基因目的基因mRNA，另一个群体不含有目的

31、基因，另一个群体不含有目的基因mRNA。以这两种总。以这两种总mRNA（或是它（或是它们的们的cDNA 拷贝）为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构件的拷贝）为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构件的cDNA文库进行文库进行筛选。筛选。20（2）减法杂交技术）减法杂交技术 减法杂交减法杂交（subtractive hybridization）又叫做差减杂交克隆、扣除杂交、减数又叫做差减杂交克隆、扣除杂交、减数杂交或消减杂交等，该技术是通过杂交或消减杂交等，该技术是通过DNA复性动力学原理富集目的基因序复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库列，并以此构建减数文库(subtract

32、ive library)的方式来进行目的基因克隆。的方式来进行目的基因克隆。减法杂交的对象可以是减法杂交的对象可以是DNA，也可以，也可以是是 cDNA，相应地称为基因组，相应地称为基因组 DNA减减法杂交和法杂交和mRNA减法杂交。后者分析差减法杂交。后者分析差异表达的基因，适于某些低丰度异表达的基因，适于某些低丰度mRNA的的 cDNA克隆。克隆。mRNA减法杂交原理：减法杂交原理：从表达目的基因从表达目的基因的组织中提取的组织中提取mRNA并反转录为并反转录为cDNA，然后与无目的基因表达的组织中提取然后与无目的基因表达的组织中提取mRNA做过量杂交，在两种组织中均表做过量杂交，在两种组

33、织中均表达的基因产物形成达的基因产物形成cDNA/mRNA 双链双链杂交分子，而特异杂交分子，而特异mRNA反转录的反转录的cDNA片段仍保持单链状态，将这种单片段仍保持单链状态，将这种单链链cDNA分离出来即为差异表达的序列。分离出来即为差异表达的序列。21（3）基因表达系列分析法）基因表达系列分析法基因表达系列分析法基因表达系列分析法(serial analysis of gene expression,简简称称SAGE)可一次对大量基因转录产物进行定量分析，从中找出可一次对大量基因转录产物进行定量分析，从中找出新的基因。新的基因。原理原理（两个）：（两个）：从转录物某一特定位置上分离得到

34、一段从转录物某一特定位置上分离得到一段910bp 的寡核苷酸序列标签的寡核苷酸序列标签(sequence tag,ST)，它含有确定，它含有确定的一个独特转录物的足够信息量，可代表此转录物的特异性。的一个独特转录物的足够信息量，可代表此转录物的特异性。理论上随机排列的理论上随机排列的9bp片断可区分片断可区分262 144（4 9）种转录物，）种转录物，人类的基因约仅有人类的基因约仅有80 000个转录子，因此，个转录子，因此，9个核苷酸序列可以个核苷酸序列可以代表所有转录子的特征。代表所有转录子的特征。多个序列标签（多个序列标签（ST）能以锚定酶）能以锚定酶(anchoring enzyme

35、,AE，识别位点为，识别位点为4碱基的限制性核酸内切碱基的限制性核酸内切酶酶)识别位点序列相隔相互连成双标签序列识别位点序列相隔相互连成双标签序列(ditag)的多联体，将的多联体，将该多联体序列克隆到一个载体中，用连续的方法进行多联体序该多联体序列克隆到一个载体中，用连续的方法进行多联体序列分析，再通过计算机处理，确定每一种序列（列分析，再通过计算机处理，确定每一种序列（ST）代表转录）代表转录产物的种类和出现频率，由此实现对转录物的高效、快速和大产物的种类和出现频率，由此实现对转录物的高效、快速和大量的分析。量的分析。第二节第二节 目的基因克隆目的基因克隆没有任何一种克隆方法能够涵盖所有好

36、处，没有任何一种克隆方法能够涵盖所有好处，克隆步骤：克隆步骤：1）克隆一个基因的方法：）克隆一个基因的方法：cDNA 合成合成 限制性核酸内切酶消化限制性核酸内切酶消化 机械剪切机械剪切 Mechanical shearing2）加到载体上：选择寄主和载体系统）加到载体上：选择寄主和载体系统平末端连接平末端连接 Blunt-end ligation使用连接头使用连接头 Use of linker molecules粘性末端连接粘性末端连接 Ligation of cohesive termini同聚物尾巴同聚物尾巴 Homopolymer tailing3）Introducing the re

37、combinant DNA into a host cell：重组质粒转化重组质粒转化 Transformation with recombinant plasmid DNA重组噬菌体重组噬菌体DNA转染转染 Transfection with recombinant phage DNADNA体外包装体外包装 Packaging DNA in vitroChapter 6第二节第二节 目的基因克隆目的基因克隆There is no single cloning strategy that will cover all requirementsA.Generation of gene fragm

38、entB.Joining to a vectorC.Introducing the recombinant DNA into a host cellcDNA synthesisRestriction enzyme digestionMechanical shearingChoose the host/vector systemBlunt-end ligationUse of linker moleculesHomopolymer tailingLigation of cohesive terminiTransformation with recombinant plasmid DNATrans

39、fection with recombinant phage DNAPackaging DNA in vitrocDNAsynthesisRestriction enzyme digestion Mechanicalshearing DirectChemicalsymthesisPackagingDNA in vitroTransformation withRecombinantPlasmid DNATranfection with RecombinantPhage DNABlunt-endligationUse of linkermoleculesHomopolyertailingLigat

40、ion of CohesiveterminiGeneration of gene fragmentChoose the host/vector systemIntroducing the recombinant DNA into a host cellChapter 6看家基因（看家基因（Housekeeping genes）：又称管家基因或持家：又称管家基因或持家基因：在所有细胞中均要表达的一类基因，其产物对维持细胞基因：在所有细胞中均要表达的一类基因，其产物对维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少（的基本结构和代谢功能是必不可少（for basic cellular metabolism）

41、，表达水平受环境因素影响较小，在各生长阶段），表达水平受环境因素影响较小，在各生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。表达只的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。表达只受启动序列或启动子与受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白他机制调节。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等基因等Housekeeping genes:for basic cellular metabolism每一个细胞都会生产大量的特殊的每一个细胞都会生产大量的特殊的mRNA Poly(A)

42、+RNA:each cell type produce different abundance classes of particular mRNAs.一、一、Cloning from mRNAChapter 6 cDNA:complementary DNA(copy DNA),poly(A)+RNA as templeReverse transcriptase=RTaseOligo(dT)primerAlkaline hydrolysis(or RNase H)to remove mRNA strandT4 DNA polymerase,klenow fragment S1 nuclease

43、 to produce a blunt-ended一、一、Cloning from mRNAChapter 6mRNAA A A A A A-35Chapter 6RTaseHO-T T T T T T-5A A A A A A-3 T T T T T T-3 T T T T T T-3NaOHOHss cDNADNA polymeraseKlenow fragment T T T T T T-3S1 nucleaseds cDNASynthesis of cDNAmRNAA A A A A A C C C C-35T T T T T T-5T T T T T T-5Alkaline sucr

44、osegradientds cDNAA A A A A A-35T T T T T T-5cDNA3CTerminal transferase+dCTP3-C C C C C CRTaseT T T T T T-53-C C C C C C5-G G G G G GAdd oligo(dG)primerChapter 6Oligo（dG）-primed second-strand cDNA synthesis CCCC3-C blunt-end ligation:S1 nuclease destroy the protruding ends of DNA;DNA polymerase(klen

45、ow fragment)filling the protruding ends of DNA.Main disadvantage:1)is an inefficient process,require high concentration DNA for ligation;2)vector self-ligate to produce circular molecules or the insert/vector DNAs may form concatemers instead of bimolecular recombinants,use phoshpatase (either BAP o

46、r CIP)to prevent self-ligation;3)cloning site disappear in the recombinant DNA2 Cloning cDNA in plasmid vectorsTwo methods:1)Ligation of blunt-end 2)Ligation of cohesive termini a.Use of linker moleculesb.Homopolymer tailingCCGAATTCGGGGCTTAAGCCLinkers:are self-complementary oligomers that contain a

47、recognition sequence for a particular restriction enzyme.DNA ligaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCC5-AATTCGG GCCCCGGGCTTAA-5EcoR IAdaptors:are single-stranded non-complementary oligomers that may be used in conjunction with linkers,when annealed together and be added to the cDNA to provide s

48、ticky-end cloning without digestion of the linkers.OH-GATCCCCGGGDNA ligaseCCCGGGGGGCCCCTAG-OH-5GGGCCCGGATCCCCTAGGBamH I+OH-GATCCCCGGG GGGCCC5-OH-GATCCCCGGG GGGCCCCCCGGGGGGCCCHpaIIHomopolymer tailing:the enzyme terminal transferase is used to add homopolymers of dA,dT,dG or dC to a DNA molecule.Pst I

49、vectorCCCCCCCC-33-CCCCCCCCInsertCTGCAGGGGGGGG-3G3-GGGGGGGGACGTCGPst I siteGGGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGGGGACGT TGCAGCCCCCCCCCCCCCCCCPst I siteEnzyme digestionTerminal transferase+dCPst I digestionTerminal transferase+dGDNA ligaseTarget geneMain advantage:1)packaging in vitro may generate the recombinant

50、phage,which increases the efficiency of the cloning process.2)much easier to store and handle large numbers of phage clones than plasmids.3 Cloning cDNA in bacteriophage vectorsIf a large number of recombinants was required,and a low-abundance mRNA was to be cloned,phage vectors may be more suitable

51、.Cloning cDNA in vectors using linkers:EcoR I methylaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCAdd EcoR I linkersds cDNAMeMeCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCDigest with EcoR ILigateInsertvectorvectorLA vectorRAgenomic library:is ofte

52、n used to describe a set of clones representing the entire genome of an organism.To determine the intronsTo examine the control sequences responsible for regulating gene expression二、二、Cloning from genomic DNA1 Genomic librariesaim of constructing a genomic library is for isolating a target DNA seque

53、nce.Clone bank(library):A collection of independent clones is termed a clone bank or library估计基因组文库大小的经验（估计基因组文库大小的经验（empirical formula）公）公式：式：N=ln(1-P)/ln(1-a/b)N:the number of clones required P:desired probability of a particular sequence being represented(0.95 or 0.99)a:the average size of the DN

54、A fragment to be cloned b:the size of the genome organismGenomeSize(kb)No.clones N,P=0.9520kb inserts45kb insertsEscherichia coli(bacteria)4.01036.01032.7103Saccharomyces cerevisiae(yeast)1.41042.11039.3102Arabidopsis thaliana(simple plant)7.01041.11044.7103Drosophila melanogaster(fruit fly)1.71052.

55、51041.1104Stroglyocentrotus purpuratus(sea urchin)8.61051.31055.7104Homo sapiens(human)3.01064.51052.0105Triticum aestivum(hexaploid wheat)1.71072.51061.1106Genetic library sizes for various organisms选择哪种载体用于基因组文库构建？选择哪种载体用于基因组文库构建？Which vector is used to choose for construction of genetic library?p

56、hage vector：有效容纳量是15kbcosmid vector：有效容纳量是45kb建立基因组文库的一般程序：建立基因组文库的一般程序：1载体载体DNA片段的制备片段的制备载体载体DNA分离纯化分离纯化 限制酶切限制酶切 脱磷酸化反应脱磷酸化反应3.供体与载体供体与载体DNA连接连接 提高重组频率，应注意连接反应体系中总提高重组频率，应注意连接反应体系中总DNA浓度和两浓度和两种种DNA分子的摩尔数比率。分子的摩尔数比率。2 供体供体DNA片段的制备片段的制备 机械剪切法机械剪切法总总DNA分离纯化分离纯化 分离特定大小分离特定大小DNA片段片段 酶法酶法 （部分酶切、完全酶切（部分酶

57、切、完全酶切）4.重组重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增分子的转移和基因组文库的扩增 利用转化或感染方法将连接好的重组利用转化或感染方法将连接好的重组DNA分子导入宿主分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率分子被扩增（重组子比率可能发生变化）。可能发生变化）。5.基因组文库质量的评价基因组文库质量的评价 1）文库规模）文库规模-随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。库大小。2）重组频率）重组频率-频率越

58、高，质量越高，可大大减轻后续频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。筛选基因工作量。Cloning DNA in vectors using linkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvectorvectorCloning DNA in vectors using linkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvectorvector1)The molecular weight of the DNA after isolation from the orga

59、nism.2)The method used to fragment the DNA.文库的连接、包装和扩增文库的连接、包装和扩增Two main consideration when preparing DNA fragment for cloning:For a completely random library,DNA molecular weight should be very high.100kb is available.Fragmentation can be achieved either by mechanical shearing or by partial digest

60、ion with a restriction enzyme.CTAGAnnealBamH I Sau3 AGCCTAGGATCC GGATC CTAGGATC GCCTAGGATC CTAGGATCC GCloning Sau3A fragments into BamH I site5-GGATCC-33-CCTAGG-5BamH I 5-NGATCN-33-NCTAGN-5Sau3 AE B SE B SEMBL 4Left armRight armS SLeft armRight armS/BS/BGATCCTAGGATCCTAGLigation of Sau3A cut DNA into

61、 the replacement vector EMBL45-GGATCC-33-CCTAGG-5BamH I 5-NGATCN-33-NCTAGN-5Sau3 AEMBL4 GATCCTAG GATC CTAGE B SE B SLeft armRight armStuffer fragmentS SLeft armS/BGATCCTAGGATCCTAGS/BRight armInsert DNASau3A cohesive endSau3A cohesive endLigation of Sau3A-cut DNA into thereplacement vector EMBL4GATCC

62、TAGGATCCTAGcoscosInsertInsertInsertcoscosLALALARARAPackaged in vitroConcatemeric recombinant DNAPrimary libraryAmplification of libraryPlating the packaged phage on a suitable host of E.coli,then resuspending the plaques by washing the plates with a buffer solutionConcatemeric recombinant DNA and am

63、plification of library 4.更先进的克隆技术更先进的克隆技术Advanced cloning strategies1)Synthesis and cloning of cDNAOkayamaBerg法法 1）T引物的合成：在质粒上进行，用于合成第一条引物的合成：在质粒上进行，用于合成第一条cDNA链链 2）G引物的合成：在质粒上进行，用于合成第二条引物的合成：在质粒上进行，用于合成第二条cDNA链链 3）第一条）第一条cDNA链合成：链合成：T引物与引物与mRNA退火退火 反转录反应反转录反应 4）第二条）第二条cDNA链的合成：链的合成：a.第一条第一条cDNA链链3-

64、末端加尾（末端加尾（dCTP）b.限制酶切除去限制酶切除去 载体上所加的多聚载体上所加的多聚C尾巴尾巴 c.与与G引物退火引物退火 d.除去除去RNA e.合成第二条合成第二条cDNA链链 5）cDNA文库的形成文库的形成转化转化 2)Expression of cloned DNA moleculesPromoter（启动子）（启动子）:are regions with a specific base sequence,to which RNA polymerase will bind.Strong promoter:强启动子强启动子Weak promoter:弱启动子弱启动子Inducib

65、le promoter:诱导型启动子诱导型启动子在原核生物中（在原核生物中（In prokaryotic promoterIn prokaryotic promoter）：）：Consensus sequence:In prokaryotic promoter,two main regions is important:Consensus sequence:In prokaryotic promoter,two main regions is important:-10 region=Pribnow box:5-TATAAT-3-35 region:5TTGACA-3真核生物中（真核生物中（I

66、n eukaryotic promoter）:Enhancers（增强子）:may be located hundreds or thousands of base-pairs upstream from the Tc start site.-25 position：CAAT box.Around-25 position with the consensus sequence 5-TATAAAT-3(the TATA or Hogness box)and a sequence in the-75 region with the consensus 5-GG(T/C)CAATCT-3,known as the CAAT box.EcoR ISac IPst IHind III1）SacI2）TdT+dTTPEcoR ISac ITTTTTHind IIITTTTTAAAAAmRNAAMV-RT+dNTPTTTTTTTTTTAAAAATdT+dCTPTTTTTAAAAATTTTTCCCCEcoR I SacIPst IHind IIICCCC1）HindIII2）取大片段）取大片段TTTT