CR基因扩增及扩增产物的回收

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1、Q&A 关于标签：关于标签：物质描述：名称，浓度，物质描述：名称，浓度，pHpH值等值等配制信息：配制人，配制日期等配制信息：配制人，配制日期等班级（周四班级（周四318318或周四佟），组别或周四佟），组别 关于试剂配制关于试剂配制 EDTA(EDTA(乙二胺四乙酸钠），碱性条件下可溶，乙二胺四乙酸钠），碱性条件下可溶，一般每百毫升加一般每百毫升加NaOHNaOH约约4g4gTris-HClTris-HCl1mol/L,pH7.41mol/L,pH7.4（25)25)生化实验室，生化实验室，MilliQ MilliQ 水水（已灭菌，（已灭菌，PCRPCR专用）专用）生化实验室，生化实验室，1

2、6401640培养基培养基含含FBS 10%FBS 10%，含双抗，含双抗（JurkatJurkat细胞专用）细胞专用）佟丽，佟丽，手术器械（已除热源）手术器械（已除热源）佟丽，佟丽，主要内容主要内容 目的基因目的基因AKPAKP的扩增的扩增PCRPCR 扩增产物的分离鉴定琼脂糖电泳扩增产物的分离鉴定琼脂糖电泳 扩增产物的回收胶回收扩增产物的回收胶回收PCRPCR产物产物目的产物 琼脂糖凝胶分析目的基因目的基因AKPAKP的扩增的扩增PCRPCR 概述概述 PCRPCR技术原理技术原理 PCRPCR特点特点 影响因素与条件优化影响因素与条件优化 关于本次实验关于本次实验PCRPCR（Polym

3、erase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）在体外特异性地扩增某个基因。在体外特异性地扩增某个基因。19931993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖Kary B.Mullis概述概述使使PCRPCR成为实用的方法成为实用的方法PCR的种类的种类常规常规PCRPCRTouch-down PCRTouch-down PCRRT-PCRRT-PCR兼并引物兼并引物PCRPCR巢氏巢氏PCRPCR反向反向PCRPCR不对称不对称PCRPCR原位原位PCRPCRRACE-PCRRACE-PCR免疫免疫-PCR(immuno-PCR)-PCR(immuno-PC

4、R)MSPMSP甲基化特异甲基化特异PCRPCR等等等等常规常规PCRPCRRT-PCRRT-PCRPCR技术原理技术原理 高温变性高温变性 低温复性（退火）低温复性（退火）适温延伸适温延伸适度循环适度循环DNADNA模板高温变性模板高温变性:双链双链DNADNA在在受热受热后，配对碱基后，配对碱基的氢键断裂，的氢键断裂，DNADNA两条链分开成为两条链分开成为单链单链。95oC3 5 TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTA5 3 5 TGCATGCATATCTTGAAC3 3 5 TAGAACTTGACGTACGTA模板（模板（template）TGCATG

5、CATATCTTGAAC3 5 5 TAGAACTTGACGTACGTA3 DNADNA模板与引物复性模板与引物复性(退火）退火）:引物引物PrimerPrimer，人工合成的单链，人工合成的单链DNADNA小片段，碱基顺序小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板分别与所要扩增的模板DNADNA双链的双链的55端相同端相同模板模板模板模板ATCTTGAAC5 3 ACGTACGTA5 3 引物引物引物引物40-65 DNADNA链的延伸：链的延伸：DNADNA聚合酶按碱基互补配对原则在模板聚合酶按碱基互补配对原则在模板上延伸上延伸DNADNA链。链。TGCATGCATATCTTGAAC3 5 5

6、TAGAACTTGACGTACGTA3 模板模板模板模板ATCTTGAAC5 ACGTACGTA5 TaqTaq72 理论上理论上25-30次循环就可以合成次循环就可以合成225-230条条DNA变性变性复性复性延伸延伸1 1个循环的结果个循环的结果新一轮循环新一轮循环PCR的特点的特点特异性强：特异性强：特异的特异的DNADNA引物。引物。高温下进行延伸高温下进行延伸敏感性高敏感性高:理论上只要一条模板链，理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约次循环就可合成约109条！条！快快 速速:整个整个PCRPCR过程约过程约2 24 4小时小时简简 便便:对模板的纯度要求低对模板的纯度要求低 模

7、板种类多样化模板种类多样化PCR反应的影响因素反应的影响因素1 1、Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶 2 2、引物、引物 3 3、模板、模板 4 4、dNTP dNTP 5 5、MgMg2+2+热稳定性，耐高温热稳定性，耐高温最适温度：最适温度：75-8075-80 延伸速度：延伸速度：2000bp/min 2000bp/min 最长延伸长度：最长延伸长度：6.7kb6.7kb没有没有3355外切酶活性外切酶活性合成超过合成超过600bp600bp长度的长度的DNADNA就有可能出现错配就有可能出现错配T aquaticusTaq DNATaq DNA聚合酶金属离子敏感（尤其是聚合

8、酶金属离子敏感（尤其是 ），），当当dNTPdNTP（能结合（能结合MgMg2+2+）mmol/Lmmol/L时，时，MgClMgCl2 2最佳浓度应是最佳浓度应是mmol/Lmmol/L。50mmol/L KCl也能激活也能激活Taq DNA聚合酶的活性聚合酶的活性。Taq DNATaq DNA聚合酶被蛋白酶聚合酶被蛋白酶K K降解降解 无无33 5DNA 5DNA外切酶活性，但高外切酶活性，但高温下能温下能逆转录逆转录cDNAcDNA，又能扩增，又能扩增DNADNA有有35外切酶活性，外切酶活性，能耐受能耐受100oC高温高温。其它耐热的其它耐热的DNADNA聚合酶聚合酶Tth DNATt

9、h DNA聚合酶：聚合酶：Vent DNAVent DNA聚合酶：聚合酶：Pfu DNAPfu DNA聚合酶：聚合酶：有有35外切酶活性，外切酶活性，是目前已发是目前已发现的所有耐高温现的所有耐高温DNA 聚合酶中出聚合酶中出错率最低的错率最低的Taq Plus DNATaq Plus DNA聚合酶：聚合酶：TaqTaq和和Pfu DNAPfu DNA聚合酶的混合物聚合酶的混合物Taq的的PCR产物产物3端往往带有一个端往往带有一个A基因工程原理（吴乃虎）基因工程原理（吴乃虎）分子克隆实验指南（第三版）分子克隆实验指南（第三版）扩增的效率和特异性扩增的效率和特异性55端根据需要可设计成某个端根

10、据需要可设计成某个内切酶的切点内切酶的切点顺序、顺序、RNARNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。方便与以后操作。33端必须与模板正确配对，端必须与模板正确配对，55端可以不配对端可以不配对5ATGACTGATCGATCGATCGAT3 3GCTAGCTACTTAAG5 templateprimerprimer2.1 引物的碱基序列：一般长引物的碱基序列：一般长1530bp尽可能提高尽可能提高G+CG+C含量含量，以提高引物与模板的结合力，以提高引物与模板的结合力避免避免连续相同碱基连续相同碱基排列或内部排列或内部回文序列回文序列

11、5GGCAGTCTGCCAGTCTAC 3 CTGCCAGTCTAC 3 GACGG 5 T发卡结构发卡结构2.2 引物的碱基组成：引物的碱基组成：2.3 引物内部不能形成二级结构：引物内部不能形成二级结构：尽可能随机分布，尽可能随机分布，G+CG+C含量含量 45-55%45-55%。两个引物间不能有两个以上连续碱基互补序列两个引物间不能有两个以上连续碱基互补序列 2.4 避免形成引物二聚体（避免形成引物二聚体（dimer）5GGTCTGCCAGTCTAC3 3CAGGACTTAGTCACT5 primer1primer2引物设计现在多用引物设计现在多用专业软件专业软件如如Primer5.0

12、Primer5.0，DNA databaseDNA database等等Tm=（G+C)4+(A+T)2Tm=81.5+16.6(lgK+)+0.41(%G+C)-675/n适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。特异性，减少非特异产物的出现。一般估计：当引物中的（一般估计：当引物中的（G+CG+C）含量低于）含量低于50%50%时，时，复性温度低于复性温度低于5555 。2.5 引物的引物的Tm值值:实际复性温度选择低于实际复性温度选择低于TmTm值值552.6 引物的浓度引物的浓度:一般使用终浓度各一般使用终浓度各 mo

13、l/Lmol/L模板的量：模板的量：不能太多不能太多，100100 l l反应体系中约反应体系中约100ng100ng纯度：纯度：PCRPCR对模板对模板DNADNA的纯度要求不高，但不能有的纯度要求不高，但不能有蛋白质变性剂、蛋白质变性剂、DNADNA酶、酶、MgMg2+2+的螯合剂的螯合剂等影响等影响DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。3.3.模板（模板（template)template)dNTPs dNTPs 是是 dATPdATP、dTTPdTTP、dCTPdCTP和和dGTPdGTP的总称，一般的总称，一般反应体系中反应体系中dNTPdNTP混合液终浓度用混合液终浓度用mmol

14、/Lmmol/L，浓度过高，浓度过高会抑制会抑制Taq DNATaq DNA聚合酶的活性并增加错配率聚合酶的活性并增加错配率 4.dNTPs4.dNTPsTaq DNATaq DNA聚合酶要求有游离的聚合酶要求有游离的MgMg2+2+。所以。所以MgMg2+2+浓度浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带），不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带），一般用一般用1.5-4.5mmol/L1.5-4.5mmol/L的的MgClMgCl2 2终浓度。终浓度。5.Mg5.Mg2+2+的浓度的浓度PCR反应的条件优化反应的条件优化变性温度和时间：变性温度和时间：92-9592-95，富含，富含G G

15、和和C C的序列，可适的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失；当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失；退火温度与时间：退火温度与时间：引物中引物中G G、C C含量高、含量高、长度长并与长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高，通常性越高，通常37-5537-55、1-21-2分钟；分钟；延伸温度和时间：延伸温度和时间：7272，接近，接近TaqTaq酶的最适酶的最适7575；延；延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间；目的序

16、列，则可适当增加时间；循环次数：循环次数：循环过多，非特异性产物大量增加循环过多，非特异性产物大量增加关于本次实验关于本次实验大肠杆菌大肠杆菌K12K12碱性磷酸酶基因序列（碱性磷酸酶基因序列（CDSCDS，1.5Kb1.5Kb）551 aag551 aagttgttgtcac ggccgagact tatagtcgct ttgtttttat tttttaatgt tcac ggccgagact tatagtcgct ttgtttttat tttttaatgt 601 atttgtacat ggagaaaata aagtgaaaca aagcactatt gcactggcac 601 attt

17、gtacat ggagaaaata aagtgaaaca aagcactatt gcactggcac 651 tcttaccgtt actgtttacc cctgtgacaa aagcccggac accagaaatg 651 tcttaccgtt actgtttacc cctgtgacaa aagcccggac accagaaatg 701 cctgttctgg aaaaccgggc tgctcagggc gatattactg cacccggcgg 701 cctgttctgg aaaaccgggc tgctcagggc gatattactg cacccggcgg 751 tgctcgccg

18、t ttaacgggtg atcagactgc cgctctgcgt gattctctta 751 tgctcgccgt ttaacgggtg atcagactgc cgctctgcgt gattctctta 801 gcgataaacc tgcaaaaaat attattttgc tgattggcga tgggatgggg 801 gcgataaacc tgcaaaaaat attattttgc tgattggcga tgggatgggg 851 gactcggaaa ttactgccgc acgtaattat gccgaaggtg cgggcggctt851 gactcggaaa ttac

19、tgccgc acgtaattat gccgaaggtg cgggcggctt901 ttttaaaggt atagatgcct taccgcttac cgggcaatac actcactatg 901 ttttaaaggt atagatgcct taccgcttac cgggcaatac actcactatg 951 cgctgaataa aaaaaccggc aaaccggact acgtcaccga ctcggctgca 951 cgctgaataa aaaaaccggc aaaccggact acgtcaccga ctcggctgca 1001 tcagcaaccg cctggtcaa

20、c cggtgtcaaa acctataacg gcgcgctggg 1001 tcagcaaccg cctggtcaac cggtgtcaaa acctataacg gcgcgctggg 1051 cgtcgatatt cacgaaaaag atcacccaac gattctggaa atggcaaaag 1051 cgtcgatatt cacgaaaaag atcacccaac gattctggaa atggcaaaag 1101 ccgcaggtct ggcgaccggt aacgtttcta ccgcagagtt gcaggatgcc1101 ccgcaggtct ggcgaccggt

21、 aacgtttcta ccgcagagtt gcaggatgcc1151 acgcccgctg cgctggtggc acatgtgacc tcgcgcaaat gctacggtcc1151 acgcccgctg cgctggtggc acatgtgacc tcgcgcaaat gctacggtcc 1201 gagcgcgacc agtgaaaaat gtccgggtaa cgctctggaa aaaggcggaa1201 gagcgcgacc agtgaaaaat gtccgggtaa cgctctggaa aaaggcggaa 1251 aaggatcgat taccgaacag ct

22、gcttaacg ctcgtgccga cgttacgctt 1251 aaggatcgat taccgaacag ctgcttaacg ctcgtgccga cgttacgctt 1301 ggcggcggcg caaaaacctt tgctgaaacg gcaaccgctg gtgaatggca1301 ggcggcggcg caaaaacctt tgctgaaacg gcaaccgctg gtgaatggca 1351 gggaaaaacg ctgcgtgaac aggcacaggc gcgtggttat cagttggtga 1351 gggaaaaacg ctgcgtgaac agg

23、cacaggc gcgtggttat cagttggtga 1401 gcgatgctgc ctcactgaat tcggtgacgg aagcgaatca gcaaaaaccc 1401 gcgatgctgc ctcactgaat tcggtgacgg aagcgaatca gcaaaaaccc 1451 ctgcttggcc tgtttgctga cggcaatatg ccagtgcgct ggctaggacc1451 ctgcttggcc tgtttgctga cggcaatatg ccagtgcgct ggctaggacc 1501 gaaagcaacg taccatggca atat

24、cgataa gcccgcagtc acctgtacgc 1501 gaaagcaacg taccatggca atatcgataa gcccgcagtc acctgtacgc 1551 caaatccgca acgtaatgac agtgtaccaa ccctggcgca gatgaccgac 1551 caaatccgca acgtaatgac agtgtaccaa ccctggcgca gatgaccgac 1601 aaagccattg aattgttgag taaaaatgag aaaggctttt tcctgcaagt 1601 aaagccattg aattgttgag taaa

25、aatgag aaaggctttt tcctgcaagt 1651 tgaaggtgcg tcaatcgata aacaggatca tgctgcgaat ccttgtgggc 1651 tgaaggtgcg tcaatcgata aacaggatca tgctgcgaat ccttgtgggc 1701 aaattggcga gacggtcgat ctcgatgaag ccgtacaacg ggcgctggaa 1701 aaattggcga gacggtcgat ctcgatgaag ccgtacaacg ggcgctggaa 1751 ttcgctaaaa aggagggtaa cacg

26、ctggtc atagtcaccg ctgatcacgc1751 ttcgctaaaa aggagggtaa cacgctggtc atagtcaccg ctgatcacgc 1801 ccacgccagc cagattgttg cgccggatac caaagctccg ggcctcaccc 1801 ccacgccagc cagattgttg cgccggatac caaagctccg ggcctcaccc 1851 aggcgctaaa taccaaagat ggcgcagtga tggtgatgag ttacgggaac 1851 aggcgctaaa taccaaagat ggcgc

27、agtga tggtgatgag ttacgggaac 1901 tccgaagagg attcacaaga acataccggc agtcagttgc gtattgcggc 1901 tccgaagagg attcacaaga acataccggc agtcagttgc gtattgcggc 1951 gtatggcccg catgccgcca atgttgttgg actgaccgac cagaccgatc 1951 gtatggcccg catgccgcca atgttgttgg actgaccgac cagaccgatc 2001 tcttctacac catgaaagcc gctct

28、ggggc tgaaa 2001 tcttctacac catgaaagcc gctctggggc tgaaataataaaa ccgcgcccggaa ccgcgcccgg碱性磷酸酶氨基酸序列碱性磷酸酶氨基酸序列 MSRPRLIVAL FLFFNVFVHG ENKVKQSTIA LALLPLLFTP VTKARMSRPRLIVAL FLFFNVFVHG ENKVKQSTIA LALLPLLFTP VTKARTPEMP TPEMP VLENRAAQGD ITAPGGARRL TGDQTAALRD SLSDKPAKNI ILLIGDGMGD VLENRAAQGD ITAPGGARRL TGDQT

29、AALRD SLSDKPAKNI ILLIGDGMGD SEITAARNYA EGAGGFFKGI DALPLTGQYT HYALNKKTGK PDYVTDSAAS SEITAARNYA EGAGGFFKGI DALPLTGQYT HYALNKKTGK PDYVTDSAAS ATAWSTGVKT YNGALGVDIH EKDHPTILEM AKAAGLATGN VSTAELQDAT ATAWSTGVKT YNGALGVDIH EKDHPTILEM AKAAGLATGN VSTAELQDAT PAALVAHVTS RKCYGPSATS EKCPGNALEK GGKGSITEQL LNARADVT

30、LG PAALVAHVTS RKCYGPSATS EKCPGNALEK GGKGSITEQL LNARADVTLG GGAKTFAETA TAGEWQGKTL REQAQARGYQ LVSDAASLNS VTEANQQKPL GGAKTFAETA TAGEWQGKTL REQAQARGYQ LVSDAASLNS VTEANQQKPL LGLFADGNMP VRWLGPKATY HGNIDKPAVT CTPNPQRNDS VPTLAQMTDK LGLFADGNMP VRWLGPKATY HGNIDKPAVT CTPNPQRNDS VPTLAQMTDK AIELLSKNEK GFFLQVEGAS

31、IDKQDHAANP CGQIGETVDL DEAVQRALEF AIELLSKNEK GFFLQVEGAS IDKQDHAANP CGQIGETVDL DEAVQRALEF AKKEGNTLVI VTADHAHASQ IVAPDTKAPG LTQALNTKDG AVMVMSYGNSAKKEGNTLVI VTADHAHASQ IVAPDTKAPG LTQALNTKDG AVMVMSYGNSEEDSQEHTGS QLRIAAYGPH AANVVGLTDQ TDLFYTMKAA LGLKEEDSQEHTGS QLRIAAYGPH AANVVGLTDQ TDLFYTMKAA LGLK质粒质粒pETb

32、lue-2pETblue-2（3653bp3653bp）图谱）图谱pETBlue-2 pETBlue-2 克隆表达区域克隆表达区域PCR PCR 扩扩 增增 实实 验验 流流 程程ddHddH2 2dNTP 4uLdNTP 4uL10 xbuffer10 xbuffer*5uL 5uL引物引物 （10umol/L10umol/L）4uL4uL模板模板DNA 1uLDNA 1uLExExTaq E 0.3uLTaq E 0.3uL（1.5U1.5U）94940 0C,5 C,5 94940 0C,1 C,1 55550 0C,1 C,1 72720 0C,2 C,2 72720 0C,10C,1

33、0 3030次次*注：PCR buffer：10mmol/L Tris-HCl pH8.4(20)50mmol/L KCl、Mg2+乙酰乙酰BSA减少减少非特异性非特异性关于对照关于对照实验组实验组：反应体系加入所有扩增所需元素：反应体系加入所有扩增所需元素 每位每位同学作两个平行反应同学作两个平行反应对照组对照组1 1：反应体系中其它成分一致：反应体系中其它成分一致 但但不不加加（用灭菌水代替），（用灭菌水代替），每位每位同学做一个反应同学做一个反应 对照组对照组2 2：反应体系中其它成分一致：反应体系中其它成分一致 但但不不加加用灭菌水代替）用灭菌水代替）每组每组做一个反应做一个反应仪器操

34、作仪器操作1：超净工作台：超净工作台（提供洁净工作环境）（提供洁净工作环境）平衡平衡对称平衡对称平衡螺紧螺紧转子盖转子盖关闭关闭离心仓上盖离心仓上盖最最 高高 转转 速速 13000rpm!注意注意安全安全仪器操作仪器操作2：离心机点甩样品：离心机点甩样品仪器操作仪器操作3：PCR仪仪主要内容主要内容 目的基因片段的扩增目的基因片段的扩增PCRPCR 扩增产物的分离鉴定琼脂糖电泳扩增产物的分离鉴定琼脂糖电泳 扩增产物的回收扩增产物的回收琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖：琼脂糖：是一种是一种线性多糖聚合物线性多糖聚合物，从红色海，从红色海藻产物琼脂中提取而来。藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖凝胶：

35、琼脂糖凝胶：琼脂糖在水或电泳缓冲液中加琼脂糖在水或电泳缓冲液中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的胶体匀的胶体胨胨 琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度 凝胶的空隙（密度）凝胶的空隙（密度）浓度高，空隙小。浓度高，空隙小。琼脂糖的浓度（琼脂糖的浓度（%）分离分离DNA的片断大小（的片断大小（bp）0.3 0.7 1.4500001000 200001000 6000300空隙大小决定其分辨分子大小的能力。空隙大小决定其分辨分子大小的能力。空隙小，分辨率高：小分子较易通过，大分子难通过空隙小，分辨率高：小分子较易通过，大分子难通过 空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通

36、过。空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。琼脂糖凝胶的分辨力琼脂糖凝胶的分辨力核酸为两性分子，核酸为两性分子，pH 8pH 8左右时，碱基几乎不解左右时，碱基几乎不解离，而磷酸全部解离，整个分子带离，而磷酸全部解离，整个分子带负电负电在碱性环境下，不同的核酸分子由于具有相同在碱性环境下，不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖结构，几乎具有的磷酸戊糖结构，几乎具有相同的电荷密度相同的电荷密度核酸分子在凝胶中的核酸分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数迁移率与其所含碱基对数目的对数值成反比目的对数值成反比。可以近似用于估算分子的大小可以近似用于估算分子的大小分离分析原理分离分析原理1 1 TA

37、E(TAE(储液为储液为5050)或者或者0.50.5TBE(TBE(储液为储液为5 5)！注意稀释后使用！注意稀释后使用常用电泳缓冲液：常用电泳缓冲液：胶浓度（胶浓度（%）溴酚蓝溴酚蓝二甲苯青二甲苯青0.60.61kb1kb1 10.6kb0.6kb2kb2kb1.41.40.2kb0.2kb1.6kb1.6kb2 20.15kb0.15kb增加样品密度增加样品密度使样品带颜色，起指示作用使样品带颜色，起指示作用本身有一定迁移率，指示相对位置本身有一定迁移率，指示相对位置载样（上样）缓冲液（载样（上样）缓冲液（loading buffer)凝胶染色凝胶染色1.溴化乙锭（溴化乙锭（Ethidi

38、um bromide，EB）扁平分子，能扁平分子，能插入插入DNADNA碱基之碱基之间间，但不与琼脂糖结合。，但不与琼脂糖结合。EBEB在在300nm300nm紫外光照射下能紫外光照射下能发发红色荧光红色荧光，即可显示，即可显示DNADNA泳带泳带在凝胶中所处的位置。在凝胶中所处的位置。荧光强度在一定范围内与荧光强度在一定范围内与DNADNA含量及大小成正比。含量及大小成正比。致癌致癌2.SYBR:2.SYBR:新型低毒，高灵敏度荧光染料新型低毒，高灵敏度荧光染料 可直接加入样品中，价格较昂贵可直接加入样品中，价格较昂贵 对对DNADNA的迁移率有一定的影响的迁移率有一定的影响3.GoldVi

39、ew3.GoldViewTMTM:无明显的致癌作用无明显的致癌作用 灵敏度与灵敏度与EBEB相当相当 加入胶中加入胶中5uL/100mL5uL/100mL胶胶 紫外灯下紫外灯下而而 对皮肤、眼睛有刺激，操作时带手套。对皮肤、眼睛有刺激，操作时带手套。凝胶染色凝胶染色关于本次实验关于本次实验PCR产物的琼脂糖凝胶电泳产物的琼脂糖凝胶电泳1 1、配制配制0.8%0.8%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 60mL(60mL(用用1xTAE1xTAE配配)1xTAE 1xTAE（60mL60mL）+g+g）微波炉热熔，室温放置约至微波炉热熔，室温放置约至6060 加入加入GoldViewGoldView（1.5u

40、L1.5uL），充分混匀），充分混匀 铺到水平制胶板上，插好梳子待凝铺到水平制胶板上，插好梳子待凝2 2、配制电泳样品：配制电泳样品：50uL PCR50uL PCR产物产物 +6uL 10 xloading+6uL 10 xloading3 3、电泳上样：电泳上样：50 uL50 uL样品样品/孔孔 5 uL DNA Marker/5 uL DNA Marker/孔孔 5 5、结果用凝胶成像仪分析照相结果用凝胶成像仪分析照相 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳产物的琼脂糖凝胶电泳4 4、电泳条件：电泳条件：8080伏恒压电泳，至溴酚兰跑至伏恒压电泳，至溴酚兰跑至3/4 3/4 胶处胶处PCR PCR

41、 扩增产物琼脂糖电泳扩增产物琼脂糖电泳2000bp2000bp1000bp1000bp水平凝胶电泳槽水平凝胶电泳槽 电泳仪电泳仪Bio-Rad全自动凝胶成像分析系统全自动凝胶成像分析系统主要内容主要内容 目的基因片段的扩增目的基因片段的扩增PCRPCR 扩增产物的分离鉴定琼脂糖电泳扩增产物的分离鉴定琼脂糖电泳 扩增产物的回收扩增产物的回收PCR产物胶回收原理产物胶回收原理硅基质材料：硅基质材料：DNADNA高盐环境与其吸附，低盐环境与其解离高盐环境与其吸附，低盐环境与其解离切胶切胶尽量精确，以尽量精确，以提高回收率提高回收率尽量减少时间，尽量减少时间，以保护以保护DNA1.1.切胶、称胶重（减

42、重法）切胶、称胶重（减重法）每每100mg100mg胶加入胶加入500uL500uL溶胶液，溶胶液，5555溶胶溶胶 ！一定要完全溶解：随时晃动目测。！一定要完全溶解：随时晃动目测。2.2.将溶解的胶液体转移至吸附柱，将溶解的胶液体转移至吸附柱，12000rpm12000rpm离心离心3030秒，去除废液秒，去除废液3.3.漂洗漂洗:向吸附柱的向吸附柱的正中央正中央加入加入500uL500uL漂洗液，漂洗液，12000rpm12000rpm离心离心3030秒，秒，去除废液。重复一次。去除废液。重复一次。4.4.空柱空柱12000rpm12000rpm离心离心2min2min，以彻底去除废液，以

43、彻底去除废液5.5.将吸附柱置于一新的干净无菌的将吸附柱置于一新的干净无菌的mLEPmLEP管中，向吸附柱的管中，向吸附柱的正中央正中央加加40uL40uL洗脱洗脱bufferbuffer或无菌水，室温放置或无菌水，室温放置5 5分钟。分钟。12000rpm12000rpm离心离心3030秒，以洗脱秒，以洗脱DNADNA。6.6.再次向柱子的再次向柱子的正中央正中央加加10uL10uL洗脱洗脱bufferbuffer或无菌水，室温放置或无菌水，室温放置5 5分分钟；钟；12000rpm12000rpm离心离心2 2分钟。合并回收液。分钟。合并回收液。7.SYBR7.SYBR检测回收产物检测回收

44、产物PCR产物的回收流程产物的回收流程若量大，需若量大，需分两次进行分两次进行避免乙醇对酶促避免乙醇对酶促反应的影响反应的影响下次实验的简介与准备下次实验的简介与准备1.LB1.LB液体培养基液体培养基 40mL/40mL/组组 胰蛋白胨（胰蛋白胨（tryptonetryptone 酵母提取物（酵母提取物（NaCl NaCl 加入加入40mL40mL水溶解后加水溶解后加8L 5mol/L NaOH8L 5mol/L NaOH，混匀，混匀，分装到大试管（分装到大试管（4mL4mL管）中管）中 灭菌灭菌后后4 40 0C C 保存。保存。配试剂配试剂2.2.氯仿氯仿:异戊醇（异戊醇（24:124:

45、1）300mL/300mL/班，充分混匀后迅速分成四份（班，充分混匀后迅速分成四份（棕色瓶棕色瓶）4 40 0C C 保存；通风厨操作保存；通风厨操作3.3.酚：氯仿：异戊醇（酚：氯仿：异戊醇（25:24:125:24:1）200mL/200mL/班，充分混匀后迅速分成四份（班，充分混匀后迅速分成四份（棕色瓶棕色瓶）4 40 0C C 保存；保存；通风厨操作通风厨操作配试剂配试剂第一组配制第一组配制第二组配制第二组配制4.4.溶液溶液 100mL/100mL/班，分成四份，班，分成四份，灭菌灭菌后后4 40 0C C 保存。保存。5.5.溶液溶液 100mL/100mL/班，分成四份班，分成四

46、份(现用现配）现用现配）6.6.溶液溶液 20mL/20mL/班，分成四份，班，分成四份，灭菌灭菌后后4C 4C 保存。保存。配试剂配试剂第五组配制第五组配制第四组配制第四组配制第三组配制第三组配制 1.1.枪头：枪头：1mL1mL、200uL200uL、10uL10uL各一盒各一盒 5ml 25ml 2个个 2.EP2.EP管：管：mLmL，4040个个 ml,10ml,10个个 3.3.前述各试剂前述各试剂工程菌的接种与培养工程菌的接种与培养 下周三下午？下周三下午？灭菌灭菌工程菌的接种与培养工程菌的接种与培养 下周三下午？下周三下午？PCRPCR引物设计范例引物设计范例引物引物1 1 5

47、GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC 3 CDS CDS 5AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT .AKP CDS.CDSCDS .CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3引物引物2 2 3GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5BamH1HindpETBlue-2 ATG GCG ATA TCC CGG GAG CTC GTG GAT CCG AAT引物引物1 1：5GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3 BamH 引物引物2 2：5GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC3 Hind