食物中膳食纤维的测定

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1、膳食纤维的测定方法酶-重量法1. 原理：样品分别用a-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶进行酶解消化以去除蛋白质和可消化的淀粉。总膳食纤维(TDF)是先酶 解，然后用乙醇沉淀，再将沉淀物过滤，将TDF残渣用乙醇和丙酮冲洗，干燥称重。不溶性和可溶性膳食纤维(IDF 和SDF)是酶解后将IDF过滤，过滤后的残渣用热水冲洗，经干燥后称重。SDF是将上述滤出液用4倍量的95%乙醇沉 淀，然后再过滤，干燥，称重。TDF、IDF和SDF量通过蛋白质、灰分含量进行校正。2. 适用范围AOAC991.43 本方法适用于各类植物性食物和保健食品。3. 仪器3.1烧杯：400或600ml高脚型。3.2过滤用坩埚：玻料滤板

2、，美国试验和材料学会(ASTM) 40-60 um， Pyrex 60ml (Corning No.36060 buchner，或 同等的)。如下处理：(1) 在灰化炉525C灰化过夜。炉温降至130C以下取出坩埚。(2) 用真空装置移出硅藻土和灰质。(3) 室温下用2%清洗溶液浸泡1小时。(4) 用水和去离子水冲洗坩埚；然后用15ml丙酮冲洗然后风干。(5) 在干燥的坩埚中加0.5g硅藻土，在130C烘干恒重。(6) 在干燥器中冷却1小时，记录坩埚加硅藻土重量，精确至0.1mg。3.3 真空装置：(1) 真空泵或抽气机作为控制装置。(2) 1L的厚壁抽滤瓶。(3) 与抽滤瓶相配套的橡皮圈。3

3、.4振荡水浴箱：(1) 自动控温使温度能保持在982C。(2) 恒温控制在60C。3.5天平：分析级，精确至土0.1mg。3.6马福炉：温度控制在5255C。3.7干燥箱：温度控制在105和1303C。3.8干燥器：用二氧化硅或同等的干燥剂。干燥剂两周一次在130C烘干过夜。3.9 PH计：注意温控，用pH4.0、7.0和10.0缓冲液标化。3.10移液管及套头：容量100U1和5ml。3.11 分配器或量筒：(1) 150.5ml，供分配78%的乙醇，95%的乙醇以及丙酮。(2) 400.5ml,供分配缓冲液。3.12. 磁力搅拌器和搅拌棒。4. 试剂全过程使用去离子水,试剂不加说明均为分析

4、纯试剂4.1 乙醇溶液：(1) 85%：加895ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。(2) 78%：加821ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。4.2 丙酮：4.3供分析用酶：在0-5C下储存。(1) 热稳定 a-淀粉酶溶液：Cat. No. A3306, Sigma Chemical Co. , St. Louis, M063178，或 Termamyl 300L, Cat. No. 361-6282, Novo-Nordisk, Bagsvaerd, Denmark，或等效的酶。(2) 蛋白酶：Cat. No. P3910, Sigma Chemical Co.，或等效的。

5、当天用MES/TRIS缓冲液中现配50mg/ml酶溶液。(3) 淀粉葡糖苷酶溶液：Cat. No. AMG A9913, Sigma Chemical Co.，或等效的。4.4 硅藻土：酸洗(Celite 545 AW, No.C8656, Sigma Chemical Co.，或等效的)。4.5 洗涤液：两者挑一。(1) 铬酸：120g重铬酸钠Na2Cr207 2H20, 1000ml蒸馏水和1600ml浓硫酸。(2) 实验室用液体清洁剂，预备急需清洗的(Micro, International Products Corp. , Trenton, NJ08016,或等效 的)。用水配制2%溶

6、液。4.6 MES-TRIS 缓冲液：0.05mol/L,温度在 24C时 pH 值为 8.2。(1) MES： 2- (N-吗啉代)磺酸基乙烷(No.M-8250, Sigma Chemical Co.或等效的)。(2) TRIS：三羟(羟甲基)氨基甲烷(No.T-1503, Sigma Chemical Co.或等效的)。在1.7L的蒸馏水中溶解19.52gMES和12.2gTRIS,用6mol/L NaOH调pH到8.2,用水定容至2L。(注意：24C时的 pH为8.2,但是，如果缓冲液温度在20C, pH就为8.3，如果温度在28C, pH为8.1。为了使温度在20-28C之间， 需根

7、据温度调整pH值。)4.7盐酸溶液：0.561mol/L,加93.5ml6mol/L盐酸到700ml水中，用水定容至1L。5. 操作方法5.1. 样品制备：(1) 固体样品：如果样品粒度0.5mm,研磨后过0.3-0.5mm (40-60目)筛。(2) 高脂肪样品：如果脂肪含量10%,用石油醚去脂。每克样品用25ml,每次提取完静置一会儿再小心将烧杯倾 斜,慢慢将石油醚倒出,共洗三次。(3) 高碳水化合物样品：如果样品干重含糖50%，用85%乙醇去除糖份，每克样品每次10ml，共洗三次轻轻倒出， 然后在40C烘箱中不时翻搅干燥过夜，并研磨过0.5mm筛。5.2. 样品消化(1)准确称取双份1.

8、0000.005g样品(M1和M2)，置于高脚烧杯中。(2) 在每个烧杯中加入40ml MES-TRIS缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌直到样品完全分散。(防止团块形成，使受试 物与酶能充分接触)。(3) 用热稳定的淀粉酶进行酶解处理：加100U1热稳定的淀粉酶溶液，低速搅拌。用铝箔片将烧杯盖住，在95-100C 水浴中反应30分钟。(起始的水浴温度应达到95C)。(4) 冷却：所有烧杯从水浴中移出，凉至60C。打开铝箔盖，用刮勺将烧杯边缘的网状物以及烧杯底部的胶状物刮 离，以使样品能够完全的酶解。用10ml蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。(5) 用蛋白酶进行酶解处理：在每个烧杯中各加入100卩l蛋白酶溶液

9、。用铝箔盖住，在60C持续摇动反应30分钟 (开始时的水浴温度应达60C)，使之充分反应。(6) pH值测定：30分钟后，打开铝箔盖，搅拌中加入5ml0.561mol/L HCL至烧杯中60C时用1mol/L NaOH溶液或 1mol/L HCL溶液调最终pH为4.0-4.7。(注意：当溶液为60C时检测和调整pH,因为在较低温度时pH会偏高。)(7) 用淀粉葡糖苷酶溶液酶解处理：搅拌同时加100卩l淀粉葡糖苷酶溶液。用铝箔盖住，在60C持续振摇反应30 分钟，温度应恒定在60C。5.3 测定5.3.1.总的膳食纤维测定(1) 用乙醇沉淀膳食纤维：在每份样品中，加入预热至60C的95%乙醇22

10、5ml，乙醇与样品的体积比为4：1。室温 下沉淀1小时。(2) 过滤装置：用15ml78%乙醇将硅藻土湿润和重新分布在已称重的坩埚中。用适度的抽力把坩埚中的硅藻土吸到 玻板上。(3) 酶解过滤，用78%乙醇和刮勺转移所有内容物微粒到坩埚中。(注意：如果一些样品形成胶质，用刮勺破坏表 面，以加速过滤。)(4) 抽真空，分别用15ml的78%乙醇，95%乙醇和丙酮冲洗残渣各2次，将坩埚内的残渣抽干后在105C烘干过夜。 将坩埚置干燥器中冷却至室温。坩埚重量，包括膳食纤维残渣和硅藻土，精确称至0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重， 计算残渣重。(5) 蛋白质和灰分的测定：取成对的样品中的一份测定蛋白质

11、，用 本书前述或GB-960.52方法测定。用(NX6.25 作为蛋白质的转换系数)。分析灰分时用平行样的第二份在525C灼烧5小时，在干燥器中冷却，精确称至0.1mg,减去坩埚和硅藻土的重量，即 为灰分重量。5.3.2 .不溶性膳食纤维测定：(1) 称适量样品按5.2进行酶解，过滤前用3ml水湿润和重新分布硅藻土在预先处理好的坩埚上，保持抽气使坩埚 中的硅藻土抽成均匀的一层。(2) 过滤并冲洗烧杯，用10ml70C水洗残渣2次，然后再过滤并用水洗，转移到600ml高脚烧杯，保留用以测定可 溶性膳食纤维，按5.3.3。(3) 用抽滤装置，分别用15ml78%乙醇，95%乙醇和丙酮各冲洗残渣2次

12、。 (注意：应及时用78%乙醇、95%乙醇和丙酮冲洗残渣否则可造成不溶性膳食纤维数值的增大。)（4）按5.3.1.5 用双份样品测定蛋白质和灰分。5.3.3.可溶性膳食纤维测定：（1） 将不溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到 600ml 高脚烧杯中，对比烧杯和滤过液，估计容积。（2）加约滤出液4倍量已预热至60C的95%乙醇。或者将滤液和洗过残渣的蒸馏水的混合液调至80g，再加入预热 至60C的95%乙醇320ml。（3）室温下沉淀1小时。下面按5.3.1测定总膳食纤维，从湿润和重新分布硅藻土。6. 计算TDF、IDF、SDF 均用同一公式计算膳食纤维（DF, g/100g）测定：DF= （R1+R2） /2-P-A/ （M1+M2）/2X100式中：R1和R2=双份样品残留物重量（mg）P和A=分别为蛋白质和灰分重量（mg）M1和M2=样品重量（mg）