发酵工程3培养基

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1、第第3章培养基章培养基培养基是什么培养基是什么?天然培养基天然培养基指一类利用动、植物或微生物体包括其提取物制成的培养基。如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。组合培养基组合培养基又称为合成培养基或综合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。半组合培养基半组合培养基指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如，马铃薯蔗糖培养基。一、发酵工业培养基的基本要求1、必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。2、有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质的转化率。3、有利于提高产物的浓度，以提高单

2、位容积发酵罐的生产能力。4、有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。5、尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。6、原料价格低廉，质量稳定，取材容易。7、所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。8、有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”物质。1、碳源作用：作用：提供微生物营养所需的碳元素，同时又提供能源。最适碳源CHO型。常用碳源：糖蜜、淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖。有些微生物可利用油脂（豆油、菜油、葵花子油等）、有机酸（乳酸、柠檬酸、乙酸等）、烃和醇类（正1418碳烷烃、乙醇等）。二、培养基的成分与来源2、氮源作用：用于构成菌体细胞物质（氨基酸、蛋白

3、质、核酸等）和含氮代谢产物。有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、尿素、酒糟等。无机氮源：铵盐（氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵）、硝酸盐（硝酸钠、硝酸钾）、氨水等。异氧微生物对氮源的利用顺序：NCHO或NCHOX类、NH类、NO类、N类。3、无机盐及微量元素主要无机元素：磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁等。微量无机元素：钼、锌、钴、铜、硼、溴等。磷、硫是构成细胞物质的重要成分，钾、钠、镁主要是调节和控制原生胶的胶体状态、维持膜的透性并激发某些酶的活性。微量无机元素量微，但往往会强烈刺激微生物的生长发育。无 机盐酶的激活剂（Cu2、Mn2、Zn2等）特殊分子

4、结构成分（Mo-固氮酶、Co维生素B12）微量元素渗透压的维持（Na等）细胞内一般分子成分（P、S、Ca、Mg、Fe等）生理调节物质大量元素一般功能特殊功能化能自养菌能源（S、Fe2、NH4等）无氧呼吸时氢受体（NO3-、SO4-等）酶的激活剂（Mg2等）pH的稳定4、生长因子生长因子是微生物生长发育过程中不可缺少而需要量又极少的一类特殊营养物质。它包括了维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶类碱基等。营养物质中的酵母膏、玉米浆或麦芽浸出物等都含有丰富的生长辅助物质。5、发酵的前体与促进剂前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构没有多大的变化，

5、但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。如青霉素G的发酵中加入苯乙酸。发酵过程中所用的一些前体物质发酵过程中所用的一些前体物质产 品 前 体 产 品 前 体 青青 霉霉 素素 G 青青 霉霉 素素 V 金金 霉霉 素素 灰灰 黄黄 霉霉 素素 红红 霉霉 素素 苯苯 乙乙 酸酸 苯苯 氧氧 乙乙 酸酸 氯氯 化化 物物 氯氯 化化 物物 正正 丙丙 醇醇 核核 黄黄 素素 类类 胡胡 萝萝 卜卜 素素 L-异异 亮亮 氨氨 酸酸 L-色色 氨氨 酸酸 L-丝丝 氨氨 酸酸 丙丙 酸酸 盐盐 -紫紫 罗罗 酮酮 a-氨氨 基基 丁丁 酸酸 邻邻 氨氨 基基 苯苯 甲甲 酸酸 甘甘 氨氨 酸酸 促

6、进剂：加入后，能使生产菌株大幅度提高目促进剂：加入后，能使生产菌株大幅度提高目标生产能力的物质。如标生产能力的物质。如MetMet或或LeuLeu促进头孢菌素促进头孢菌素C C的生物合成；聚乙烯醇衍生物防止菌丝结球，的生物合成；聚乙烯醇衍生物防止菌丝结球，提高糖化酶的产量；添加表面活性剂，可增加提高糖化酶的产量；添加表面活性剂，可增加底物和产物的渗透性，促使固体物分散，强化底物和产物的渗透性，促使固体物分散，强化传质和传氧，从而促进产物的生产。传质和传氧，从而促进产物的生产。三、微生物的培养基类型1.天然培养基(natural medium)凡利用生物的组织、器官及其抽取物或制品配成的培养基，

7、称为天然培养基。优点是配制方便、经济、营养丰富，但是，它的化学成分不清楚或不稳定(受产地、品种、保存加工方法等因素影响)。常见的天然培养基成分有：麦芽汁、肉浸汁、鱼粉、麸皮、玉米粉、花生饼粉、玉米浆及马铃薯等。v用于天然培养基的原料(玉米淀粉等原料)往往需要进行去杂、粉碎等处理，然后进行过筛、输送至发酵罐。表表 几种天然培养基原材料的特性几种天然培养基原材料的特性原材料制作特点营养价值牛肉膏瘦牛肉加热抽提并浓缩而成的膏状物主要提供碳水化合物(有机酸、糖类)，有机氮化物(氨基酸、嘌呤、胍类)，无机盐(钾，磷)和水溶性维生素(主要为B族)蛋白胨酪素、明胶或鱼粉等蛋白质经酸、酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、

8、木瓜蛋白酶)水解而成主要提供有机氮、维生素及碳水化合物酵母膏(酵母粉)酵母细胞水抽提物浓缩而成的膏状物或粉剂提供大量的B族维生素，氨基酸，嘌呤碱及微量元素玉米浆用亚硫酸浸泡玉米制淀粉时的废水，经减压浓缩而成的浓缩液。干物质占50%，棕黄色，久置沉淀提供可溶性蛋白质、多肽、小肽、氨基酸、还原糖和B族维生素。2.合成培养基(synthetic medium)使用成分完全了解的化学药品配制而成的培养基称为合成培养基。合成培养基的优点是：成分已知、精确、重复性好。但价格较贵，培养的微生物生长较慢。适用于实验室进行微生物生理、遗传育种及高产菌种性能的研究。培养放线菌的高氏一号培养基和培养真菌的察氏培养基

9、都属于合成培养基。3.半合成培养基半合成培养基(semi-defined medium)由部分天然材料和部分已知的纯化学药品组成由部分天然材料和部分已知的纯化学药品组成的培养基称为半合成培养基。的培养基称为半合成培养基。例如，培养真菌用的马铃薯蔗糖培养基等。严例如，培养真菌用的马铃薯蔗糖培养基等。严格地讲，凡含有未经特殊处理的任何合成培养格地讲，凡含有未经特殊处理的任何合成培养基，实际上都只是一种半合成培养基。特点是基，实际上都只是一种半合成培养基。特点是配制方便，成本低，微生物生长良好。发酵生配制方便，成本低，微生物生长良好。发酵生产和实验室中应用的大多数培养基都属于半合产和实验室中应用的大

10、多数培养基都属于半合成培养基。成培养基。4.液体培养基(liquid medium)各营养成分按一定比例配制而成的水溶液或液体状态的培养基称为液体培养基。工业上绝大多数发酵都采用液体培养基。实验室中微生物的生理、代谢研究和获取大量菌体是也常利用液体培养基。5.固体培养基(solid medium)固体培养基一般是指液体培养基中加入一定量的凝固剂配制而成的固体状态的培养基。此外，固体营养物(如麸皮、米糠、木屑、土豆块、玉米粉)与水和盐等混合构成的疏松状培养基也属于固体培养基。固体培养基在科学研究和生产实践中具有很多用途，例如它可用于菌种分离、鉴定、菌落计数、检测杂菌、选种、育种、菌种保藏、抗生素

11、等生物活性物质的效价测定及获取孢子等。6.半固体培养基(semi-solid medium)半固体培养基是指琼脂加入量为0.2-0.5%而配制的固体状态的培养基。半固体培养基有许多特殊的用途，如可以通过穿刺培养观察细菌的运动能力，进行厌氧菌的培养及菌种保藏等。7.种子培养基(seed culture medium)种子培养基是适合微生物菌体生长的培养基，目的是为下一步发酵提供数量较多，强壮而整齐的种子细胞。一般要求氮源、维生素丰富，原料要精。9.基本培养基(Minimal Medium，MM)基本培养基又称最低限度培养基，指能满足某菌种的野生型(原养型)菌株最低营养要求的合成培养基。不同微生物

12、的基本培养基很不相同，有的极为简单，如大肠杆菌的基本培养基；有的极为复杂，如一些乳酸菌、酵母菌或梭菌的基本培养基。基本培养基有时也需要添加生长因子等。若在基本培养基中加入富含氨基酸、维生素、碱基等生长因子的营养物质，如蛋白胨、酵母膏等，就可满足各种营养缺陷型的生长需求，这种培养基称为完全培养基(Complete Medium，CM)。若在基本培养基中只是针对性地加入一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型生长，那么，这种培养基称为补充培养基(Supplement Medium,SM)。10.加富培养基(enriched medium)加富培养基是在普通培养基中加入血、血清、动(植)物组织液或

13、其它营养物(或生长因子)的一类营养丰富的培养基。它主要用于培养某种或某类营养要求苛刻的异养型微生物，或者用来选择性培养(分离、富集)某种微生物。具有助长某种微生物的生长，抑制其它微生物生长的功能。广义上讲，保藏培养基和鉴别培养基也属于加富培养基。选择性培养基的设计主要方法有两种：v一是根据某些微生物对碳源、氮源的需求而设计。以纤维素为唯一碳源的培养基可用于分离纤维素分解菌；用石蜡油来富集分解石油的微生物；用较浓的糖液来富集酵母菌等。v二是根据某些微生物的物理和化学抗性设计的，如分离放线菌时，在培养基中加入数滴10%的苯酚，可以抑制霉菌和细菌的生长；在分离酵母菌和霉菌的培养基中，添加青霉素、四环

14、素和链霉素等抗生素可以抑制细菌和放线菌的生长；结晶紫可以抑制革兰氏阳性菌，培养基中加入结晶紫后，能选择性地培养革兰氏阴性菌；7.5%NaCl可以抑制大多数细菌，但不抑制葡萄球菌，从而选择培养葡萄球菌。12.鉴别培养基(differential medium)在培养基中添加某种或某些化学试剂后，某种微生物生长过程中产生的特殊代谢产物会与加入的这些化学物反应，并出现明显的、肉眼可见的特征性变化，从而使该种微生物与其它微生物区别开来。这种培养基称为鉴别培养基。例如：用于检测饮水、乳品中是否含肠道致病菌的伊红-美兰乳糖培养基，即EMB(Eosin Methylene Blue)培养基。其成分是：蛋白胨

15、10克，乳糖10克，K2HPO4 2克，2%伊红 20ml，0.325%美兰20ml,蒸馏水1000ml,pH7.2 其中的伊红和美兰两种苯胺染料可以抑制革兰氏阳性菌和一些难培养的革兰氏阴性菌。试样中的多种肠道菌会在EMB培养基上产生相互易区分的特征菌落，因而易于辨认。大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量混合酸，使菌体带H+，很容易染上酸性染料伊红，伊红又与美兰结合，其复合物为黑色，所以，大肠杆菌的菌落呈紫黑色并带金属光泽，菌落较小。产气杆菌产酸弱，菌落呈棕色；变形杆菌不能发酵乳糖，菌落无色、透明。四、发酵培养基设计的原理1、营养物质应满足微生物的需要不同营养类型的微生物对营养的需求差异很大，

16、所以，应根据所培养菌种对各营养要素的不同要求进行配制。而且，营养物的浓度及配比应恰当，营养物的浓度太低，则不能满足微生物生长的需要，浓度太高，又会抑制微生物的生长。如糖和盐都是良好的营养物质，但是，浓度升高，则有抑菌作用。碳氮比碳氮比(C/N)一般指培养基中元素一般指培养基中元素C与与N的比值。的比值。为方便测定和计算，人们常以培养基中还原糖为方便测定和计算，人们常以培养基中还原糖含量与粗蛋白含量的比值来表示。含量与粗蛋白含量的比值来表示。在考察培养基组成时，人们常以碳氮比作为一在考察培养基组成时，人们常以碳氮比作为一个重要的指标。一般培养基的个重要的指标。一般培养基的C/N比为比为100：0

17、.5-2；在谷氨酸生产菌发酵中，；在谷氨酸生产菌发酵中，C/N比为比为4/1时，时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累量较少；当菌体大量繁殖，谷氨酸积累量较少；当C/N为为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸大量积累。时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸大量积累。在设计营养物配比时，还应该考虑避免培养基在设计营养物配比时，还应该考虑避免培养基中各成分之间的相互作用。如蛋白胨、酵母膏中各成分之间的相互作用。如蛋白胨、酵母膏中含有磷酸盐时，会与培养基中钙或镁离子在中含有磷酸盐时，会与培养基中钙或镁离子在加热时发生沉淀反应。在高温下，还原糖与蛋加热时发生沉淀反应。在高温下，还原糖与蛋白质或氨基酸也会相互作用产生褐色物质

18、。白质或氨基酸也会相互作用产生褐色物质。在培养基配制时，可添加化学试剂补充宏量元在培养基配制时，可添加化学试剂补充宏量元素。其中，首选的是素。其中，首选的是K2HPO4和和MgSO4，因为，因为它们包含了四种宏量元素。对于微量元素，一它们包含了四种宏量元素。对于微量元素，一般化学试剂、水及器皿上均有存在。般化学试剂、水及器皿上均有存在。2、菌体的同化能力、菌体的同化能力有些微生物能分泌水解酶（淀粉酶、蛋白有些微生物能分泌水解酶（淀粉酶、蛋白酶等），能利用淀粉、黄豆粉、花生饼粉、玉酶等），能利用淀粉、黄豆粉、花生饼粉、玉米浆等复杂原料作为培养基；而不能分泌水解米浆等复杂原料作为培养基；而不能分泌

19、水解酶的微生物则只能利用小分子物质，以淀粉为酶的微生物则只能利用小分子物质，以淀粉为原料时需先进行原料时需先进行“糖化糖化”处理。处理。3 3、培养基对菌体代谢的阻遏与诱导的影响、培养基对菌体代谢的阻遏与诱导的影响在配制培养基考虑碳源和氮源时，应根据微生在配制培养基考虑碳源和氮源时，应根据微生物的特性和培养的目的，注意速效碳（氮）源物的特性和培养的目的，注意速效碳（氮）源和迟效碳（氮）源的相互配合，发挥各自的优和迟效碳（氮）源的相互配合，发挥各自的优势。势。葡萄糖效应：当菌体利用葡萄糖时产生的代谢葡萄糖效应：当菌体利用葡萄糖时产生的代谢产物会阻遏或抑制某些产物合成所需的酶的形产物会阻遏或抑制某

20、些产物合成所需的酶的形成或酶的活性。成或酶的活性。在酶制剂生产过程中，应考虑碳源的分解代谢在酶制剂生产过程中，应考虑碳源的分解代谢阻遏的影响。对许多诱导酶来说，易被利用的阻遏的影响。对许多诱导酶来说，易被利用的碳源不利于产酶，而一些难被利用的碳源对产碳源不利于产酶，而一些难被利用的碳源对产酶有利。酶有利。微生物利用氮源的能力因菌种、菌龄的不同而微生物利用氮源的能力因菌种、菌龄的不同而有差异。在生长早期容易利用易同化的铵盐和有差异。在生长早期容易利用易同化的铵盐和氨基氮，在生长中期则由于细胞代谢酶系已形氨基氮，在生长中期则由于细胞代谢酶系已形成，利用蛋白质的能力增强。因此，在培养基成，利用蛋白质

21、的能力增强。因此，在培养基中有机和无机氮源应当混合使用。中有机和无机氮源应当混合使用。有些产物受氮源的诱导与阻遏。除个别微生物有些产物受氮源的诱导与阻遏。除个别微生物外（如黑曲霉生产酸性蛋白酶需高浓度的铵外（如黑曲霉生产酸性蛋白酶需高浓度的铵盐），通常蛋白酶的产生受培养基中蛋白质或盐），通常蛋白酶的产生受培养基中蛋白质或脂肪的诱导，而受铵盐、硝酸盐以及氨基酸的脂肪的诱导，而受铵盐、硝酸盐以及氨基酸的代谢阻遏。这时应选取蛋白质等有机氮源为主。代谢阻遏。这时应选取蛋白质等有机氮源为主。2）渗透压）渗透压等渗溶液适宜微生物的生长，高渗溶液会使细胞发生质壁分离，而低渗溶液则会使细胞吸水膨胀。3）氧化还

22、原电位）氧化还原电位一般来说好氧微生物的Eh值为+0.3-+0.4V；兼性厌氧微生物在+0.1V以上时进行好氧呼吸，在+0.1V以下时则进行发酵，厌氧微生物只能在+0.1V以下才能生长。5、在设计培养基时，还应特别考虑到代谢产物是在设计培养基时，还应特别考虑到代谢产物是初级代谢产物，还是次级代谢产物。若是次级初级代谢产物，还是次级代谢产物。若是次级代谢产物还要考虑是否加入特殊元素代谢产物还要考虑是否加入特殊元素(如维生素如维生素B12中的中的Co)或特定的前体物质或特定的前体物质(如生产卞青霉素如生产卞青霉素时，应加入苯乙酸时，应加入苯乙酸)。在设计培养基尤其是大规模发酵生产用的培养在设计培养

23、基尤其是大规模发酵生产用的培养基时，还应重视培养基中各种成分的来源和价基时，还应重视培养基中各种成分的来源和价格，应该优先选择来源广泛、价格低廉的培养格，应该优先选择来源广泛、价格低廉的培养基，提倡基，提倡“以粗代精以粗代精”，“以废代好以废代好”。五、培养基的优化五、培养基的优化1 1、单因子试验、单因子试验2 2、数理统计学方法优化、数理统计学方法优化正交试验正交试验因子设计试验因子设计试验最陡爬坡试验最陡爬坡试验中心组合试验中心组合试验研究方法研究方法单因子实验单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验。优点：一次可以进行多种条件的实验，可以在

24、较快时间内得到的结果。缺点：如果考察的条件多，实验时间会比较长，各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性。数理统计学方法数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。匀设计、响应面设计。优点：同时进行多因子试验，可考察因子间的交互优点：同时进行多因子试验，可考察因子间的交互作用。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实作用。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。存在较大的误差就会得出错误的结果。