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1、骨髓培养及染色体标本制备 操作流程细胞培养：1 准备 1 个培养瓶， 加入 10.0ml Irvine Scientific 公司的陈氏培养基 BMC2. 样品加入前， 37 预温。3. 加入0.5ml（500 M）的骨 髓样品。女口果外周血中 白细胞30000 x 109个/毫升，加入少量的样品。如果外周血中白细胞5000 x 109个/毫升，加入较多的样品。4 摇匀，放入二氧化培养箱孵育 1-2 天。收获试管：1. 用无菌移液管（不要倒）把培养瓶中的培养液转移至 15 ml 的离心管中2. 然后每个离心管中加入 80M（ 0.08ml ）脱碳秋水仙碱（10Ag/ml）。盖上盖，轻 轻的多次
2、颠倒直到样品混合均匀。3. 放入37.0 C孵育箱20分钟。4. 转速 1200，离心 8分钟。吸去上清液5. 用手指拨动试管底部以混匀沉积细胞。 把试管放在涡旋器上， 速度设定在慢档， 很慢的加入 10ml0.075M KCL 低渗液。6. 室温静置 20 分钟（低渗处理） ，离心 8 分钟7. 去除上清液，留下大约 1ml 的低渗液和沉积细胞。注意有时纤维性的物质经过 离心与细胞一起混合沉积，部分浮在上清液里，用离心机抽吸最后几毫升的上 清液时，容易把纤维性的物质和细胞一起抽吸掉。为防止这种 情况发生，可用 巴士德吸管人工吸掉上清液。8. 用手指拨动试管底部以混匀沉积细胞。 把试管放在涡旋
3、器上， 速度设定在慢档， 很慢地加入 10ml 3：1 甲醇：乙酸的固定液。9. 室温静置 15 分钟（第一次）10. 转速 1200 ，离心 8 分钟。11. 去上清液，混合沉积细胞，象前一次一样加入固定液5ml。（第二次）12. 转速 1200 ，离心 8 分钟。13. 去上清液，混合沉积细胞，象前一次一样加入固定液5ml。（第三次）14. 转速 1200 ，离心 8 分钟。制片：1. 离心5 ml的细胞悬液，去上清液2. 在少量固定液中混匀细胞。具体的量决定于细胞的多少。制片前，把预处理的玻片用超 净水冲洗后，并浸没。3. 用干净的镊子，把玻片从水中取出，用吸水纸吸取多余的水份，留下薄薄
4、一层水膜。擦 去玻片反面的水珠，立即开始滴片。4. 用巴士德吸管混匀细胞悬液。吸取少量的细胞悬液（够滴一张片子）。不要把细胞悬液 吸上太多，以防细胞黏附在吸管，导致细胞丢失。5. 用以下的两种方法滴片a. 以30。角度竖起玻片，吸管距离玻片0 - 3cm滴1-2滴的细胞悬液在近毛玻片处， 让细胞悬液向下流，用吸水纸吸去多余的水。b. 平放玻片，吸管距离玻片0 -3cm， ，滴 1滴的细胞悬液在玻片中央处，用吸水 纸在边缘吸去多余的水。用这种方法时，不要滴两滴在玻片上，导致细胞不均匀的 干燥。6. 让细胞悬液均匀的分布到玻片上。干燥时应在1-2分钟。7. 将片子置于45-6OC的烤箱中过夜，染色
5、前还需要在90心的烤箱中烤15-30分钟。 染色：（1）放置6个染色缸#1(100ml)98ml生理盐水缓冲液2ml胰岛素储存液12.8mg/ml*用 0.2M Na2HP0 4 调节 pH 致 7.0#2(100ml)100ml生理盐水缓冲液（pH 7.0）#3(100ml)100ml生理盐水缓冲液（pH 7.0）#4(50ml)24ml麦氏染色缓冲液16ml蒸馏水14ml磊氏染色储存液1.6mg/ml#5(100ml)100ml蒸馏水#6(100ml)100ml蒸馏水2）染色时，把玻片完全浸入染色缸中缸#1胰岛素储存液 10-20秒缸#2冲洗液完全浸洗缸#3 冲洗液完全浸洗缸#4 染色2 1/2 -3分钟缸#5 冲洗液完全浸洗缸#6 冲洗液完全浸洗（3）磊氏染色储存液会形成一种发亮的浮在表面的物质，染色前要先用吸水纸吸去。4）用吸水纸吸干或空气吹干片子。
骨髓培养及染色体标本制备操作流程
