免疫组化总结(转载)

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1、细胞化学(imm unocytochemistry)技术。2、原理按照抗原抗体反应和化学显色道理，组织切片或细胞标本中的抗本来和一抗结合，再操纵一 抗与标识表记标帜生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用符号辣根过氧化物酶(HRP) 或碱性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如链霉亲和素等)结合，最后通过呈色反应或荧光来显现 细胞或组织中化学身分，在光学显微镜或荧鲜明微镜下可清楚瞥见细胞内产生的抗原抗体反 应产品，从而可以在细胞爬片或组织切片上原位肯定某些化学成分的散布和含量。3、分类1) 按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸 酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为

2、免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2) 按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)。与直接法相比， 间接法的灵敏度提高了许多。3) 按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)法；亲和毗连，如蛋 白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶保持(SP)法等， 个中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生 物素含量高的组织抗原检测。4、现在几种常用免疫组化方法简朴引见1）免疫荧光方法是最早成立的免疫组织化学技术。它哄骗抗原抗体特异性结合的原理，先将 已知抗体标上荧光素，

3、以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下考察。 当抗原抗体复合物中的荧光素受激起光的照耀后即会收回一定波长的荧光，从而可肯定组织 中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速 简洁，所以在临床病理诊断、查验中利用较广。2）免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年月成长起来的技术。基来源根基理是先以酶标记的 抗体与组织或细胞作用，然后到场酶的底物，天生有色的不溶性产品或具有一定电子密度的 颗粒，通过光镜或电镜，对细胞轮廓和细胞内的各类抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术 是今朝最常用的技术。本方法与免疫荧光技术相比的主要长处是：定位精确，比

4、照度好，染 色标本可持久留存，合适于光、电镜研究等。免疫酶标方法的开展十分敏捷，已经衍生出了 多种标记方法，且随着方法的精益求精和立异，其特异性和敏捷度都在不息提高，使用也愈 来愈便当。今朝在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。3）免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特别的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶， 它能疾速而不变地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有显著的影响。是以，用胶体金标记 一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针，就能对 组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同巨细的颗粒

5、，且胶 体金的电子密度高，所以避免疫胶体金技术分外得当于免疫电镜的单标记或多标记定位研 究。由于胶体金本身呈浓至深白色，因此也适合进行光镜窥察。如运用银加强的免疫金银法 例更便于光镜视察。5、被检测的物资组织或细胞中但凡能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、 激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。6、特性1）特异性强。免疫学的根本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组 化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示 淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。2）敏感性

6、高。在利用免疫组化的肇端阶段，由于手艺上的限定，只有直接法、直接法等敏感 性不高的手艺，当时的抗体只能稀释几倍、几十倍；而今因为ABC法或SP三步法的出现， 使抗体稀释上千倍、上万倍乃至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体 抗原反应，使免疫组化方法愈来愈便利地运用于通例病理诊断事情。3）定位正确、形状与功用相结合。该技能通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中 进行抗原的精确定位，因此可同时对差别抗原在统一组织或细胞中进行定位调查，这样就能 够进行形态与功效相结合的研究，对病理学范畴展开深切研究是非常成心义的。7、从蛋白程度检测角度，免疫组化技术与Western blott

7、ing、ELISA的异同Western blotting :蛋白质免疫印迹，也是操纵抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来 检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能越发准确；当 然Western blotting也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白离别检测其中抗原 含量，进而间接反应它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。2）ELISA：酶联免疫吸附实验，也是使用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀 浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最正确，是排泄性蛋白检测首选方法之一。实验流程简介1、SP三步法1）石蜡切片，常规脱蜡至水。2）0

8、.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟4）候选步调：采取抗原建复：微波（发起30分钟内4次中水）、高压、酶修复要领。天然热却， 再用3分钟x3次.5）血清封闭：室温15-30分钟，尽量与二抗来历分歧。倾往，勿洗。6）滴加适当比例稀释的一抗，37C孵育23小时或4C过夜（最好复温）。PBS冲洗，3分钟x5 次。7）滴加生物素标志的二抗，室温或37C孵育30分钟-1h。8）PBS冲洗，3分钟x5次。9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37C孵育30分钟-1h。10）PBS冲洗，3分钟x5次。11）显色剂显色

9、（DAB等）。12）自来水充裕冲洗。13）可进止复染，脱水，通明。14）选择适当的封片剂封片。2、即用型二步法1）脱蜡、水化组织切片。2）根据所应用的一抗的非凡要求，对组织切片进行预处置。3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS 冲洗。4）滴加一抗，室温或37C孵育3060分钟，或4C留宿，PBS或TBS浸洗3分钟x5次。5）滴加enhangcer加强剂，37度30min, PBS或TBS浸洗3分钟x5次。6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37C孵育30分钟-1h, PBS/TBS冲洗，3 分钟x5次。7）应用DAB溶

10、液显色。8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。3、免疫荧光技术（略）枢纽环节分解（较前有所更新）1、酶免疫组化的环节环节1）标本固定：固定的目的是防止标本从玻片上脱落；除去防碍抗原-抗体结合的类脂， 使抗原抗体结合物易于取得杰出的染色结果；固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用 4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用Bouins液或mDF液效果较好。2）脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片 时刀片要干净和厉害。否则，容易裂片和脱片等。3）脱蜡和水化：这是为了前面的抗体等试剂可以或许充实与组织中抗原等结合反映。脱蜡可 以先60度20min,然后当即二

11、甲苯1-3别离10min（这个时间是由二甲苯新颖水平和室温等 综开决议的），但当天造好的切片一般先60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和 火化不全易出现局灶性回响反映和浸洗不齐，而产生非特异性后台着色。4）抗原修复：因为组织中部门抗原在甲醛或多散甲醛牢固进程中，发作了蛋白之间交联及醛 基的封闭感化，从而落空抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决意族从头表露，进步抗 原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为多少种（详细的可以查阅相干材料，年夜量的：中性的、高pH的等）。我们实行室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。留意微波修复

12、后天然冷却30min阁下（只要你感觉修复液的温度达室温便可）。5）细胞通透：目标是使抗体可以或许充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以消融细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子构造的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为保举使用，这样抗体就可以顺遂进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用Triton X-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。冋时也是一种去污剂，一般在PBS中插足后终浓度是0.05%即可，而前者末浓度是0.5%-1%。石蜡切片4um左左可以欠亨透，因为细胞曾

13、经被切开了。6）灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易支到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD 般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般1030min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在回护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4度避光保存。不过，目下当今已有第二代即用型免疫组化试剂盒避免内源性生物素的干扰，引荐使用。7）血清封闭：组织切片上有盈余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后绝结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗

14、冋一来历的，血清中动物本身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也能够用小牛血清、BSA、羊血清等，但不克不及与一抗来源一致。一般室温10-30min。但也要防止封闭过分8）抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包罗孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45mm。具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵

15、育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4度最佳，反应温文，但时间最好超过1624h。9）抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成分外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，反抗体的多次收受接管行使较好。正因为这种原因，我一向用国产的公用抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果（提醒可能一抗没有结合），最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。10）切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，

16、以是适本地增强清洗（延长时间和增屡次数）尤其重要，我一般在一抗孵育前的洗濯是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。留意：单独冲洗，防止交叉反应造成污染。温顺冲洗，防止切片的脱落。我喜好用浸洗方法；冲洗的时间要充足，才气完全洗来结合的物资。PBS的PH和离子强度的运用和要供。这方面我有惨重教导，其时我买的抗体稀释液偏酸，成绩配景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有益于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于剖析；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而咼离子强度则有利于合成）11）DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅都

17、可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，首要由显微镜下节制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这极可能说明你的抗体浓度太高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；另外，若很短 时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；dab 显色时间很长如跨越十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度太低或孵育 时间太短最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。12）复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，常常用苏木素复染胞核 染料）。注意

18、苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般 数秒喽攵分钟，胞浆蛋白可以适事先间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不睬 想可以弥补的。方法是：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。 盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数 秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。13）封片：为了历久保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生机泡，方法是直接在载玻 片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的谁人拐角，接近封 片液近真个拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面

19、在接续弥散时，则可以 迟缓降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。2、免疫荧光方法中的重要环节1）冰冻切片制备：建议用新陈组织，否则组织细胞内部布局粉碎，易使抗原弥散。选用洁净 尖利的刀片、组织必定要冷冻适度等，防止裂片和脱片宽重。2）组织切片固定：切好片风干后立刻用冰丙酮等固定液进行固定5-10min,尤其要较长时间 保存的白片，一定要实时固定和适当保存。3）血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗起原同寺）封闭，削弱冃景着色。血清封闭的时间疋可以调整的，般10 30min4）抗孵冃条件：在免疫组化反应中取重要，包孕孵冃时间和抗体浓度。抗孵冃温度有几种：4度

20、、室温、37度，个中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有闭，一般37度1-2h而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45mino具体条件还要试探。5）二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，如果稀释液还要摸索浓度，切纪要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索 抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗跟着生存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注重配制时小包装和并进行适当的离古道热0 方 ft6）复染：目标是形成细胞表面，从而更好地对方针蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。7）封片：为了恒久保存，我

21、们一般用缓冲苦油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液c避免产活力泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一脚拿劈面的阿谁拐角，靠近封片液远真个拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现1液体打仗面在不休弥散时，则可以迟缓降低另一拐角，这样一般不会产气愤泡。8）切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗延长时间和增加次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意（1单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2温柔冲洗，防止切片的脱 落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底

22、洗去结合的物质。PBS的PH 和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一 片黄未见特异性染色），建议PH在7.4-7.浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利 于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而 高离子强度则有利于分解）9）摄影：有条件的话最好当即拍照，若不能实时照相，也要封好片和用指甲油封固，连结避 光和干度。使用荧光显微镜注意严酷依照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随便改 动法式；应在暗室中进行查抄；防止紫外线对眼睛的侵害，在调整光源时应戴上防护眼镜； 搜检时间每次以12h为好，凌驾90

23、min，超高压汞灯发光强度逐步降落，荧光削弱；标本 受紫外线映照35min后，荧光也明明减弱或退色；激起光长时间的照耀，会发生荧光的衰 加和淬灭现象；所以最多不得超过23h；荧鲜明微镜光源寿命有限，标本应集合搜检，以 节流时间，庇护光源。天热时，应加风扇散热降温，新换灯胆应从最先就记实使用时间。灯 燃烧后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次扑灭光源。封闭汞灯 最少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观测，因时间暂了荧光会逐步减弱。若将标本放 在聚乙烯塑料袋中4C保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体， 都必须厚度匀称，无显明的自觉荧光，如果使用油镜，还

24、必须包管镜油为无荧光镜油;电源最好装稳压器，否则电压不稳不但会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。3、免疫组化和免疫荧光成果阐明：见第 场实验讲座。案例一 DAB染色后切片着色一片黄/背景深背景：奥运会时代我们课题组研究生都在实验室做实验，许多从北京米办的试剂买不到，对我们的许多实验产生了很大的影响。我以前一向用中杉金桥的SP三步法染色试剂盒，效果不错，在奥运会时期我筹办做同批实验分不同批次酶免疫组化实验，第一批组化实验结果很好，抗体浓度感受比较符合（Santa Cruz公司1： 200），等做第二批时发现封闭血清不够了，为了保证实验顺遂进行，我又从祸州迈新顶了一个SP试剂盒，同时抗体稀释液也

25、不够了，我又从新从专士德公司买了一小瓶10ml。从第二批实验开端，组化实验结果不断显示强背景着色,特异性染色很难分辨。问题及其解答：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些?如何解决?1、抗体孵育时间过长、抗体浓度咼易增加背景着色。这可通过缩短一抗二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。2、一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。3、内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4、非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5、DAB孵育

26、时间过长或浓度太高；6、PBS冲洗不充分，残留抗体结果加强着色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤为重要；7、标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。 我的实践解决方案：以上的剖析可能对付初学者仍是不简单的，上面我就把我的清扫尝试的具体过程与各人进行 分享、交换和会商。1、起首清除抗体孵育条件。一般来讲，着色效果的黑白与抗体的孵育条件是稀弗成分的， 由于用SP法已做出来过一次且效果不错，因而对于一样组织的同一抗原进行分析，这种因 素可以先清扫。2、其次，DAB孵育时候是不是太少?做出去那一次我是孵育8min,厥后也是8-10min,我 零丁做了一次尝试来解除该身分。成果孵育2、5mi

27、n时先泛起布景，而特异性染色较浅， 故那没有契合常理，普通先出现特同性染色，然后跟着工夫的耽误，会呈现非特同性后台着 色。3、最后，血清封闭的问题?从前我一般孵育15-30min，所以我单独做了一次实验用血清封 闭室温1h,其它条件同做出来的那一次，结果也一样背景着色很深。4、此外，我在改良的同时，也对PBS清洗不竭地延长时间和增加次数，乃至完全参照试剂 盒仿单来进行操作（我之前一般一抗4度过夜且室温复温45min、二抗37度30min、SP反应37度30min），和过氧化氢灭活加强等等均未起到效果。我沉着地分析了一下整个实验流程,与第一次做出来比拟，只有两个处所做了窜改：因血清不敷而改换了不

28、同厂家试剂盒、因抗体稀释液用完而从头买了抗体稀释液。5、我用PBS替换一抗稀释液（我之前借收受接管抗体，自我以为抗体稀释液中含防腐剂和蛋白不变剂），别的步调和组织切片完整与第一次做出来的一致包罗血清也是老试剂盒内残剩的一点），古迹出现了：成效很好。-由于抗原抗体反应除温度、抗原/抗体浓度中，然后就是PH值，因而我测了新抗体稀释液、老抗体稀释液和PBS的PH值，了局是前者偏酸性（6、0），然后二者均在7、5阁下。6、看来重要祸端是抗体稀释液的PH值出问题了，因而我又用PBS替换抗体稀释液和新试剂盒内的试剂对组织切片做了免疫组化，效果照旧没有做出来：背景很深。这实把我搞惨了。莫非另有什么缘故原由吗

29、?通过细心分析：一抗必然是结合上去了（老SP试剂盒结果很好），题目是二抗没有结合上去也差池（因为最后背景很深，这阐明二抗可能也结合上去了），DAB孵育时间此刻只用1、5min也是背景深而特异性染色浅，那我又思疑封闭血清了。7、我做了两张切片：一张用老试剂盒内还剩下一点的血清而另一张用新试剂盒内的封闭血清，另U的试剂（二抗、SP）均用新试剂盒供给的，结果是前一张效果很好，尔后一张能够看到特异性染色，但背景太深，拍照效果欠安。-看来封闭血清也是功会罪魁之一。结果分析表现:抗体稀释液的PH值偏低和封闭血清的生效导致了我的免疫组化结果的不佳,看大师在今后的组化实验中也要注意这两个不太惹人注意的要害问题

30、。-凄惨的教训，值得引觉得鉴。案例二DAB染色后切片着色呈阳性后果背景：实在免疫组化在DAB染色后一般有四种情形：阳性染色效果很好、阴性染色、非特异性染色很深、阴阳脸（染色不平均）。而阴性染色是很多初学者常常碰到的头痛问题。我身旁有个研讨生同窗在我们真验室初度涉入免疫组化，传闻步骤不难，跟我背面做了几回以后，就本身起头做了，持续做了三次，结果均是阴性染色。很失望，不知是什么缘由招致的。问题及其解问：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些?1、抗体浓度和质量问题和抗体来源选择毛病。不知抗体是入口的照样国产的工作液，怎样么高稀释度也没能做出阳性结果?另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体

31、反应有前带和后带效应，必需探索最佳浓度。2、抗原修复不全，对甲醛固定的组织必需用充分抗原修复来翻开抗原表位，以利于与抗体 结合；建议微波修复用高火4次*6min尝尝。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不 可，还可高压修复。3、组织切片自己这种抗原含量低；4、血清封闭时间过长。5、DAB孵育时间过短。6、细胞通透不全，抗体已能充实进进胞内介入反应。7、入手下手做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。 我的现实办理计划：1、起首，破除组织切片内的抗原有没有丧失及其含量几多。免疫组化中两个最紧张的身分 是抗原和抗体。（1）抗原有没有丢得首要看组织切片的奇怪水平，一般

32、切片室温保留超越3-6 个月，可能切片内的抗原丢掉很严峻（有文献撑持），此时可以通太重新用白腊块切片来进一 步考证（蜡块需要高温留存）。（2）白腊切片在建造历程中大概果醛基对立原决定族的封闭，这 需要通过抗原修复来充裕露出，从而删加抗原抗体结合反应，提高阳性率，我一般用6min*4(3)组织抗原封闭不全。撤除查抄的抗原之外，组织中还可能存在类属抗原(如Forssman氏抗(7)抗和二抗孵育前提和浓度分歧适。调剂一抗和二抗孵育条件和浓度至最好。(8) 一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。2、阴性染色产生的缘由有：(1) 一抗和二抗浓度不适合或孵育前提不当。(2) 荧光素提早

33、阑珊。荧光本质量欠安或操纵过程当中出有留意躲光等避免荧光素阑珊的事 项。(3) 血清封闭时间过长。(4) 抗体稀释液PH值分歧适，影响抗原抗体反应。(5) 组织切片不服、裂片或脱片很严重，易引起大块阴性着色。(6) 组织标本不新颖或已冷冻组织制成的切片中抗原易弥集，易引发原本表达的部位阴性染 色或弱着色。(7) 荧光显微镜不会使用，引发波长选择错误。已有的常见免疫组化困难散锦1、石蜡切片和冰冻切片的比较？(1) 要求做冰冻切片的纷歧定能做石蜡切片，这是明天我背一教员就教得出的结论。因为作 石蜡切片时要高温烤片，可能会毁坏组织的抗原性，假如组织的抗原性较不乱，则可作石蜡 切片；然则要求做石蜡切片

34、的，可作冰冻切片。(2) 冰冻切片的劣点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这 一步。错误谬误是细胞内易形成冰晶而破损细胞布局，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡 的厚，做的片子没石蜡的标致。当你买一抗时，目次上都写着做什么样的切片，如果它写着 只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。(3) 石蜡切片的长处可以连结组织细胞的形态构造，且容易寄存在室温，而冰冻切片对照费 事，一定要存在-80度的低温冰箱中，特别是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降 解，保留一向很重要。由于石蜡切片可以切到4微米摆布，所以原位纯交探针容易渗入到组 织中去，轻易胜利，并且得到

35、的色彩/形态都较冰冻切片好。2、一抗的选摘要点和技能是甚么？(1) 单克隆和多克隆抗体的挑选。由一种克隆发生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗 体能方针明白地取单一的特异抗原决议簇连系，就像导弹切确天射中目的一样。另外一方面， 即便是统一个抗本决意簇，在机体内也能够由好几种克隆来发生抗体，构成好几种单克隆抗 体稠浊物，称为多克隆抗体。正在抗原抗体反响中，一样平常单克隆抗体特异性强，但亲和 力相对小，检测抗原活络度相对便低；而多克隆抗体特异性稍强，但抗体的亲和力强，活络 度下，但易出现非特异性染色(能够经由过程封锁等制止)。使用规模的选择。有的一抗只能用于Western blotting，或免

36、疫组化、免疫荧光、免疫沉淀 等；以至讲明石蜡切片或冰冻切片。种属反应性的选择(species reactivity)。这一点很重要，表白这类抗体可能存在种属差 异，且这种抗体合适检测哪一种种属动物体内的抗原。(4) 种属起原，一般兔滥觞的多是多克隆；而小鼠泉源的多是单克隆，但也有别的。凭据此 根源来选择相应的二抗。(5)出产厂家的选择。如santa Cruz公司抗体一般lml，价钱2100元左右；而chemicon公司 一抗一般100ul，价钱2800元左右。这两个厂家的同一种抗体它的实际效价不乱是不同的， 我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做Western blotting效果还可以

37、。3、在甚么环境下利用TritonX-100?(1) Triton X-100化学称号为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学(10um 薄切片)和免疫细胞化学中一般用Triton X-100作为细胞通透剂，在膜上挨孔。(2) 其作用原理：Triton X-100可以消融细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大 分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能逆利 进入胞内与相应抗原结合。(3)Triton X-100既是一种概况活性剂，也有抗氧化作用，具体参阅:、封闭血清的选择原则是什么？(1)膜上或切片上有残剩的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续

38、结果的假阳性！(2)封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物本身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。(3)也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。5、抗体孵育条件的比力？(1)一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，此中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。(2)二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索。6、一抗4度孵育后为何要进行37度复温？(1) 一圆里，防备切片从4度间接放进PBS易脱片；(2) 另一方面，使抗原抗体结

39、合更波动。一般不需要但对表达较弱的抗原可能有效,4度和37 度时分子活动体式格局不同，前者分子碰碰机率和活动速度小于后者，后者结合更快,但敏感 性也提高了并易造成非特异染色。(3) 实在，我更附和后一种道法，因为我测验考试把肝脏或睾丸电影从4渡过夜拿出后，曲 接用PBS洗没收生过脱片征象。究竟胜于雄辩！7、DAB显色时间如何掌控？(1) DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲 洗；(2) DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度 过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；(3) 此外，若很短时

40、间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延 长封闭时间；(4) DAB显色时间很长(如跨越十几分钟)才出现阳性染色，一方面能够申明您的抗体浓度太 低或孵育时间太短(最好一抗4度留宿)；另外一方面就是封闭时间太长。8、免疫组化成绩若何阐发？(1) 阳性着色细胞计数法。在40*光镜下，随机选择不堆叠的10个视家，野生或机械计数阳 性着色细胞，每组36张不同动物组织切片，然落后行组间比拟即可。(2) 灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择沟通地区、不异条件下用 image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。(3) 评分法。通过在光学显微镜下对组织切片划分按染色

41、程度(03分为阴性着色、淡黄色、 浅褐色、深褐色)、阳性局限进行评分(14分为025%、2650%、5175%、76100%)， 终究可以分数相加，再举行对照。关于以上这几种方法，各有益弊，请仔细选择。要念获得(2)抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，倡议试用单克隆抗体看看。(3)内源性过氧化物酶和死物素在肝净、肾脏等构造露量很高(含血细胞多的组织)，需求经由(4)没烤好，时间短温度不敷之类。(5) 操作的时辰甩的太猛了，有脱片怀疑的片子最好不甩或轻沉甩，用卫生纸从边沿上渐渐 吸水。(6) 修复的成绩：抗原修复的时刻高压时间太长了，或放进100度的修复液时伎俩欠好，咚 的一声就拾出来了，如许超轻

42、易脱片。别的，用EDTA修复比柠檬酸轻易脱片，可是你要 用到EDTA的时辰也没法子，只要从别的的题目上动手。(7) 此外，一旦见到有组织漂起来操作就愈加要谨严，用PBS的时分只管用泡的，不冲要。 根基上把这些方面都注意到了，能改擅的尽量改进，脱片可以削减许多。16、背景染色较深的原因有哪些？(1) 抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决法子是，每次使用新抗体前该当 对其工作浓度进行测试，使每抗体个别化，找到适合自己实验室的幻想工作浓度，既使是即 用型的抗体也应如斯，不能只简单的按说明书进行染色。(2) 抗体孵育时间过长或温度较高：解决设施是，严厉履行操作规程，最好随身佩戴报时表 或报时钟，及时提示，避免因忘记而造成时间延长。目前风行的二步法(Polymer)敏感性很 高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调 整。(3) DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，若有沉渣应进行过滤后再用。配制好的