免疫组化基础知1

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1、免疫组化基础知识生物谷网站免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、 金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的 研究，称为免疫组织化学。免疫组化实验所用的抗体有哪些？免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分 泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物 后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前

2、者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻 切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片， 有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露 有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同 时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复 或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有

3、空间形态。常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是p H6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组 织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素一一抗生物素染色法最常用。抗体交叉反应的原因：指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方 面：1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗 原

4、分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将 与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。2. 共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。3. 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇 的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小 于吻合时的结合力。欢迎常到免疫版讨论区做客我为人人，人人为我免疫细胞化学技术一、免疫细胞化学技术的概述*免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）-是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金

5、属 离子、同位素）显色来确定细胞内抗原的成分（主要是多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定 量的研究，称为。（一）对抗原和抗体的要求*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。-对抗体的要求：纯度高、比活性强；*高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。-对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。(二)抗原(antigen, Ag)*抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性:-免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；-免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。*根据抗原是否显示免疫原性分

6、为: -完全抗原：分子量较大，一般在lOkDa以上，并具有较复杂的化学组成。*免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有 良好的免疫原性。-半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。*半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。载体*通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin， KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum a lbumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin, OVA)等。-用戊二醛或碳化二

7、亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合 比例为5kDa结合525个分子的小肽。(三)抗体(antibody, Ab)1、抗体的概念：*机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称 为抗体。-抗体主要存在于血清内；-抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。*单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。-特异性强、抗体产量高。*多

8、克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。-特异性低，会产生抗体的交叉反应。-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。3、抗体的制备多克隆抗体的制备*动物的选择* 佐剂(adjuvant)*免疫方法*免疫剂量*抗体效价的测定*放血或定期抽血动物的选择选择什么动物来免疫取决于：*所需抗血清的量-小鼠只能提供1.01.5ml的血液，而山羊能提供几升。*能供免疫用的抗原量g足够，而山羊需要几毫克。-小鼠50(1) 动物的选择(续)*动

9、物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最 常用。(2) 佐剂(adjuvant)*一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫 刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。*最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为： -弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant)-弗氏完全佐U（Freunds complete adjuvant）弗氏不完全佐剂（Freunds inco

10、mplete adjuvant, FIA）*是由油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或Tween80）混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1, 可根据需要而定，通常2:1。*使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。弗氏完全佐剂（Freunds complete adjuvant, FCA）*在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌（终浓度为220mg/ml）,即成为FCA。*免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1混合乳化后（油包水）注入动物。-一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。佐剂与抗原乳化的方法*研

11、磨法：适于制备大量的佐剂抗原-先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同 一方向研磨，使菌体完全分散。-按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后, 应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。*缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。佐剂与抗原乳化的方法（续）*注射器混合法-将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀, 往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。*优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。*缺点：不易乳化，时间长。佐剂与抗原乳化的方法（续）*快速乳化

12、法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。-每次乳化1015s,然后置冰箱lmin左右。反复乳化34次即可完全乳化。管内残余量800r/ min离心510min收集。*优点：简单、快速、节省材料。乳化剂的鉴定*判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不 散开，表示乳化达到要求。(3)免疫方法免疫途径*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。*一般采用多点注射方法-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后

13、等处的皮内或皮下。-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。(3)免疫方法免疫途径(续)*几点说明：-大动物一般不用腹腔注射-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射g抗原即可获得较好的免疫效果。比抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10100-皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。(3)免疫方法一一次数及间隔时间*次数一般为23次(初次免疫和加强免疫)-首次注射后，1015天再加强注射；-剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。*间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长-豚鼠、大鼠为78天，兔子为1015天，羊为1428天；-第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。举例1：家兔的免疫*初

14、次免疫g Ag加入FCA,在背部皮下注射68点，每点0.10.2ml,也可肌肉内或皮内注射；卩-用50*两周后，加强免疫g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；卩-将50200*抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者 在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔*一般选择2.53.0kg的新西兰种公兔-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml（卡介苗每兔合5mg）；-10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全

15、福氏 佐剂混合乳化；g;片以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为2 550-末次注射两周后兔耳放血测价（可达1:128）。举例3：豚鼠和大鼠的免疫*初次免疫g Ag加入FCA，在背部皮内注射46点，每点比用10100 0.1ml，也可肌肉内或皮下注射；*加强免疫g Ag于PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；卩-每隔78天，将1050*抗体效价的检测（4）免疫剂量*抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；*免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。免疫剂量（续）*各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量（5）抗体效价的检测多采免疫双向扩散法

16、【基本原理】*指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。-将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。*优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。免疫双向扩散法的操作步骤*将玻璃板用水洗净后用75%乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。*将1 % agar融化后，置56 C水浴。*在玻璃板上铺胶，约1.5mm厚，凝固后打孔（直径3rnm）,孑L间距10mm。l抗血清（抗体预先作系列倍比稀释即卩1抗原样品，周围孔内每孔加中心孔加5 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32 等比例）。

17、*凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。*观察结果。抗体效价检测的其它方法*环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；*对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；*酶联免疫吸附试验（ELISA）。放血或定期抽血常用以下3种方法*颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山 羊、绵羊等动物采血常用此法。*心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。*静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日 1次，有时可采集多量血液。放血或定期抽血（续）*采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血

18、*血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白（例如蛋白水解酶）将污染抗体并 将抗体水解，降低效价；*加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。二、组织和细胞标本的制备*标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件*免疫组化对组织和细胞标本的要求-保持所检标本原有的结构、形态；-在原位最大程度地保持待测抗原（或抗体）的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。*免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有 其特殊要求及注意事项。-各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的 最佳方法。免疫组

19、化中常用的组织和细胞标本*组织标本-石蜡切片-冰冻切片*细胞标本-组织印片-细胞培养片（细胞爬片）-细胞涂片（一）石蜡切片*石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法-最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；-石蜡块还能长期存档，供回顾研究。*石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大 多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。1、取材的特殊要求及注意事项*标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h,组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或 严重弥散。*取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同

20、时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。-细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。1、取材的特殊要求及注意事项（续）*避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用 锋利的刀刃；-镊取组织动作要轻；-经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。2、固定及常用的固定液*取材后的组织需立刻投于固定剂中-固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持 原有结构和形态；-对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。*常用固定液：固定剂品种很多，但大多

21、属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。-醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）-醇类（常用乙醇）-其它（丙酮）醛类*甲醛（福尔马林）应用最广-原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。-优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。-缺点：*甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；*醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；*分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成 假阴性的染色结果。-注意事项：C）,为此组织块不宜过厚。*缩短固定时间，降低固定温度（4*改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.27.4 O.

22、Olmol/L的磷酸盐缓冲液配制成10%甲醛固定液, 减少固定液pH的变化。*固定后充分水洗以减少分子间交联。*切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现（抗原修复）。*戊二醛：-穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。*多聚甲醛（常用4%）：-可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。*主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇（C D）、主要组织相容性抗原等。醇类*最常用的醇类固定剂是乙醇。-其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。-优点：穿透性强、抗原性保存好。-缺点：*脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片

23、质量，因而乙醇固定时间不宜过长（2h内）。*乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反 应强度。（3）其它固定剂*丙酮：-对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。3、抗原修复原因*常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。*要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。3、抗原修复方法*化学方法*加热方法-水浴加热法-微波照射法-高压加热法-酸水解法(1) 化学方法*主要

24、是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。C, 1040min，主要用于细胞内抗原的显示；。-胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%0.1%，消 化时间为37C、30180min，主要用于细胞间质抗原的显示。-胃蛋白酶：一般使用浓度为0.1%0.4%, 消化时间为37*例如:Laminin、CollagenIV(2) 水浴加热法*将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续1015分钟。-优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室，-缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。(3) 微波照射法*将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95C以上，持续l015

25、分钟，冷却后, 按免疫组化染色步骤进行。*此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常, 且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。(4) 高压加热法暴露抗原*将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压1 2下一页23m in,可取得极好的效果。*由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。（1）酸水解法*酸水解可使交联断裂、暴露抗原。*将玻片浸入1mol/L HC1溶液中，室温作用20min（温度升高，作用时间缩短）。*此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。加热法的注意事项C以上）；*达到规定的温度（9295*

26、维持一定的时间；*避免切片干涸（抗原可能完全丢失）；*加热后必须经过室温自然冷却2030分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；*修复液：-最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液；-最新研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液（pH8.0）。4、载玻片的处理*抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防止脱片，常用 粘附剂处理载玻片。-新载玻片上有油污，要用洗液浸泡1224h，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗；用绸布擦干 或烤箱烤干。清洁的载玻片再用粘附剂处理。*常用的粘附剂有：-APES （3-氨丙基三乙氧基硅烷）-Polv-L-Lysine

27、 （多聚赖氨酸）-铬明胶溶液APES（3-aminopropyltriethoxysilane）3-氨丙基三乙氧基硅烷*现用现配。用纯丙酮或甲醇配制2%APES（v/v）;*将洗净的玻片浸于此液中2030秒钟;C烤箱烤干。*取出稍停片刻，再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES,置通风橱中晾干或60Polv-L-Lysine （多聚赖氨酸）C烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。C放置30min，然后60og/ml（10%w/v）的多聚赖 氨酸溶液中（去离子水稀释），37卩*将清洁玻片浸于100铬明胶溶液*试剂：铬明矶（chrome alum） 0.25g明胶（gelatine） 2.5g蒸馏水5

28、00mlC水浴中使明胶溶化，搅拌均匀后，即可使用。如有残渣，可过滤后再用。C少量蒸馏水 中，再加入明胶及蒸馏水，可在70。*先将铬明矶溶解于40*用时稍加溶化，切片浸入23min,过夜晾干。（二）冰冻切片*冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。*在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。-缩短了制片时间-抗原性不受损失*对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。*组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严 重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。1、冰冻组织块的常用方法C）中1020sec；。*液氮中冰冻：组织投入液氮中（一 19

29、6C，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好;。*干冰中加入丙酮（或异戊烷），液体立即气化起泡，温度降至一 70-上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。C冰箱。-制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-702、切片 *供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。*载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂；m。yC。切片厚度一般为48。*切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-253、切片后处理C丙酮固定lOmin，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20C。*切好的冰冻切片，室温下自 然晾干12h后，入4*冰

30、冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片, 且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。（三）组织印片*将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮 或醋酸-乙醇固定lOmin，自然干燥后染片或-20C保存。（四）细胞培养片（细胞爬片）*贴壁细胞培养C固定1020min），再进行免疫染色。时，置盖片于培养瓶中，使细胞在 盖片上生长，达适当密度后取出固定（丙酮-20-盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。-为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。（五）细胞涂片*大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：-血液、尿液

31、、脑脊液；-体腔积液；-组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织-悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。（五）细胞涂片（续）*细胞涂片的方法：-手涂法*将细胞浓度调节到106/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。*图片范围应小于lcm直径，以节约试剂。-涂片机涂片法l *将细胞样品制成2x1056/ml细胞悬液，吸取50100 (12x1045cells)加入涂片机 内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。三、免疫组化常用的染色方法*根据标记物的不同分为-(一)免疫荧光法-(二)免疫酶标法-(三)亲和组织化学法(一) 免疫荧光法【原理】*用于免疫荧光的标记

32、物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；*荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低 的荧光，籍此可作定位观察或示踪；*借助于荧光显微镜进行观察。1、常用的荧光素*(1)异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate, FITC)*(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC)*(3)四乙基罗丹明(RB200)*(4)碘化丙啶(propidium iodide, PI)(1) 异硫氰酸荧光素(FITC)*易溶于水和乙醇。*最大吸收光谱为490495nm,最大发射光谱为5

33、20530nm.呈翠绿色荧光，分子量389.4。*在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的 荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记1520个FITC分子。(2) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)*最大吸收光谱550nm,最大发射光谱620nm,呈红色荧光，分子量为444。*与蛋白质结合的方式同FITC。(3)四乙基罗丹明(RB200) *不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。*最大吸收光谱为570nm,最大发射光谱为595600nm,呈橙红色荧光，分子量为580。-氨基反应而标记在蛋白分子上。s*RB200在五氯化磷(PC15)作用下转变成磺酰氯(SO2C1),

34、 在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸(4)碘化丙啶(PI)*是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色。*PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择。*最大吸收光谱是493nm,最大发射光谱是630nm,呈红色荧光。2、荧光抗体的保存*一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。C可保存34年。C可保存12年，-20。-一般认为04-要小量分装，防止反复冻融。-保存前需加防腐剂(浓度为1:500010000的硫柳汞或1:10005000叠氮化钠)。3、免疫荧光的染色方法*免疫荧光染色法常用的有-直接法-间接法 原理将荧光素标记在相应的抗体上，直

35、接与相应抗原反应(用来检测未知抗原)。 直接免疫荧光法的操作步骤*标本的处理：-细胞涂片、细胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min,然后用0.01M PBST (含 0.1% TritonX-100 pH 7.4)漂洗 5min x 3/次;-石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min x 3/ 次；C 湿盒内封闭 30mino*2%BSA 或 10%BSA37*抗体染色：C孵育30min；。-在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中,37直接免疫荧光法的操作步骤（续）k*0.01mol/L PBS（pH 7.4

36、）漂洗5min x 3/次，不时震荡（洗去多余游离的荧光素标记的抗体）。*缓冲甘油封片-分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2, 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。*镜检：在荧光显微镜下观察。*优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。*缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制 备多种相应的荧光标记抗体。直接免疫荧光法的注意事项卩*对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；* 一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 直接免疫荧光法的注意事项（续）卩*染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；-染

37、色时间：从10 min到数小时，一般30 min；C的低温，延长染色时间C可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒） 可采用0-2oC），高于37。-染色温度：多采用室温（25C 30 min效果好的多。-低温染色过夜较37直接免疫荧光法的注意事项（续）卩*试验时需设置下列对照：-自发荧光对照（空白对照）：标本加0.01mol/L, pH7.4的PBS代替一抗。-阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。-特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。*若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性

38、染色。直接免疫荧光法的注意事项（续）卩*一般标本在高压汞灯下照射超过3min,就有荧光减弱现象；*经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。（2）间接法又称为荧光抗-抗体法9需要两种抗体参与，即一抗和二抗（荧光素标记）。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用, 但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。-可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。间接免疫荧光法操作步骤K*标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；* 一抗染色：C过夜。OC作用30min或4。-加未标记的特异性抗体（通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的P BS稀释），37*0.01M PBST漂洗5

39、minx3次（震荡漂洗）；间接免疫荧光法操作步骤（续）K* C湿盒避光作用30min。加荧光标记的二抗抗体，37*0.01M PBST避光漂洗5minx3次（例如包上锡纸，在摇床上漂洗）；*甘油缓冲液封片*镜检*优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗;*缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。间接免疫荧光法的注意事项卩*荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4C保存4h,时间过长，会使荧光减弱。*每次试验时，需设置以下三种对照：-阳性对照：阳性血清+荧光标记物-阴性对照：阴性血清+荧光标记物 -荧光标记物对照：PBS+荧光标记物间接免疫荧光

40、法的注意事项(续)卩*标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。*一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光 染色。(二) 免疫酶酶标法【原理】*以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位；*酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。1、常用的标记酶及其显色底物*辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)及底物*碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物(1) 辣根过氧化物酶(HRP)及底物*HRP是应用最广的一种酶，来源于植物辣根，由无色的酶

41、蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成, 分子量约40kDa,稳定性好；*底物为过氧化物和供氢体(DH2)-过氧化物：常用过氧化氢和过氧化氢尿素。-供氢体：多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化型染料，最常用的供氢体是DAB。DAB (二氨基联苯胺)*DAB本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不易褪色，电子密度高，最为常用。*目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。(2) 碱性磷酸酶(AP)及底物*AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fast blue)或坚牢红(fasta-萘酚磷酸盐，经水解后得a-偶氮偶 联反应，底物为red)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红

42、色。-靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP),经 酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。2、常用的免疫酶染色方法 *又分为以下两种方法：-酶标抗体法*直接法*间接法-非标记抗体酶法*酶桥法*PAP 法(1)酶标抗体法*通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显 色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。-优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。-缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶

43、的活性；易产生非特异染色。(1)酶标抗体法直接法将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最 后用底物显色剂显色。(1) 酶标抗体法间接法*将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗酶标抗 体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。酶标抗体间接法的操作步骤*标本准备：-石蜡脱蜡至水；C丙酮固定10min, O.O1M。-冰冻切片浸入4 PBST漂洗，5minx3；C丙酮固定10min,再0.01M PBST漂洗，5minx3； -细胞爬片先用PBS洗，然后4*石蜡切片需要进行抗原修复，其

44、它标本则不用；(2) 酶标抗体间接法的操作步骤(续)*封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2-甲醇溶液室温孵育510min (湿盒内)；*0.01M PBST 漂洗，5minx3；*510%正常山羊血清（0.01M PBS稀释）封闭，室温孵育30min （湿盒内）；C过夜（湿盒内）；OC孵育60min或4。*倾去血清勿洗，加1%BSA（PBST配制）稀释的一抗，37（2）酶标抗体间接法的操作步骤（续）*0.01M PBST 漂洗，5minx3；C 30min ；。*加HRP标记的二抗室温孵育lh或37*加0.01%H2020.05%DAB显色（显色液应新鲜配置）；*经PBS漂洗3次后，梯度酒精脱水

45、，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。（2）非标记抗体酶法酶桥法*首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体；*以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上；*再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的分布-优点：任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对 抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。但抗酶抗体不易纯化。几点说明*一抗（假设来自种属A）的稀释度可大些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合。*二抗一一桥抗体（抗种属A的IgG抗体）应过量，使其Fab段一个与一抗结合，另一个则游 离。*因抗酶抗体与一抗均系种属A IgG，具有相同的抗原性，所

46、以桥抗体游离的Fab能与抗酶 抗体结合，起桥作用，将其连接在与组织抗原结合的一抗上。（2）非标记抗体酶法PAP法*与酶桥法相似，不同的是，PAP法将酶桥法的第3、4步并为1步，用PAP复合物代替；*PAP是离体制备的复合物（HRP-抗HRP）。*显色与酶桥法相同，PAP复合物中的过氧化物酶催化底物水解，形成不溶性终产物。PAP法评价 *PAP法比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱 抗原的检测。-缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床常规检查。*由于常做石蜡切片，故可用于回顾性研究。(三) 亲和组织化学法*是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。*这种

47、方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。生物素一抗生物素染色法【原理】*生物素(biotin)又称维生素H,是一种小分子维生素，分子量为244,是转氨甲酰基化过程 中的辅酶。*抗生物素(avidin)，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具 有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基都 有生物素的结合位点。*两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生 物素-抗生物素系统。-该系统一端偶联大分子生物反应体系，另一端连结标记物，后者加入酶的底物，产生颜色 反应。(1)标记抗

48、生物素一生物素法(labelled avidin-biotin method, LA：分为直接法和间接法。*直接法用生物素标记第一抗体，与抗原结合；酶标记抗生物素，与生物素结合，然后进行酶呈色反 应。*间接法用生物素标记二抗，酶标记抗生物素，先用第一抗体与组织抗原结合，再将第二抗体与第一 抗体相连结，最后进行呈色反应。(2) 桥抗生物素一生物素法(bridge avidin-biotin method， BRA-此法是用生物素分别标记抗体和酶，以抗生物素为桥，把二者连接起来，进行呈色反应。(3) 抗生物素-生物素-过氧化物酶法(ABC 法)*ABC法是在BRAB和LAB的基础上改良的方法。*ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将其与过量的抗生物素反应而制备的。*分为直接法和间接法。-直接法是生物素标记的一抗与ABC复合物结合；-间接法是生物素标记的二抗与ABC复合物结合。ABC法的评价*敏感性强：ABC法比PAP法敏感性高2040倍。*特异性强，背景染色淡：由于敏感性高，一抗和二抗都可被稀释至可能的浓度，减少了非 特异染色。*方法简便，节约时间。可由PAP法所需的2天缩短至几个小时。*由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫。BR上一页12