免疫组化-书

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1、第一节 免疫组织化学及应用高鹏山东大学医学院病理教研室一. 概念免疫组化技术(immunohistochemical technique)是利用抗原抗体反应 进行的检测方法，即应用标记好的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标 本中的相应抗体或抗原。它的特点是具有高度的特异性和敏感性。将试剂 抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物(例如放射性核素、荧光素、酶 等)进行标记，则在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗 原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用， 进一步提高了免疫技术的敏感性。二. 标记物首先被用作标记免疫技术中标记物的是荧光素。1941年Coons建立的

2、荧光抗体技术(fluorescentantibody technique)使组织和细胞中抗原物质的 定位成为可能。放射性核素作为标记物在免疫技术中的应用又开创了特异 性的超微量测定。 1956 年 Yalow 和 Berson 建立的放射免疫测定 (radioimmuno assay，RIA)很快普遍应用于体液中的激素、微量蛋白及药 物的测定。 1966 年 Nakene 和 Pierce 利用酶使底物显色的作用而得到与荧 光抗体技术相似的结果。 70 年代初，酶标抗体技术开始应用于免疫测定， 其后得到迅速发展。由此发展而来的免疫组化技术在临床病理方面应用地 最为广泛。三常用方法举例免疫组化常

3、用方法有：直接法、间接法、 ABC 法(卵白素-生物素复 合物法)、 LSAB 法(标记的抗生蛋白链菌素-生物素法)，其中后两种敏感 度较高、特意性较强，是目前常用的良种方法。以下是ABC法的示意图：A为卵白素，B为生物素，P为过氧化物酶，DAB为显色剂-二氨基联苯胺 四免疫组化的应用1应用于肿瘤分期1. 1 肿瘤的早期浸润癌的早期浸润通常指癌侵透基底膜，但深度不超过 5 毫米。含基底膜成分的抗体有助于确定基底膜的完整性，两种最常用的抗体是IV型胶原或 层粘蛋白（LN）抗体。免疫组化染色显示基底膜缺如或明显断裂可确定有 微浸润。1. 2 隐匿性微转移免疫组化检测骨髓及淋巴结隐匿性转移癌，其原理

4、是利用抗体能区别 不同组织来源细胞的能力，从而将上皮癌细胞与骨髓及淋巴结内的正常结 构区别开来。 Guterson 等发现，通过较细致的组织形态学观察或免疫组化 方法来寻找淋巴结隐匿性微转移，约有 8%-30%常规淋巴结组织病理检查 “阴性”的乳腺癌病人可被检出有隐匿性微转移。2. 检测肿瘤相关抗原2. 1甲胎蛋白（AFP）AFP 主要用于原发性肝细胞癌或性腺外某些生殖细胞肿瘤（如内胚窦 瘤）的诊断和鉴别诊断。肝癌病例癌组织中 AFP 的阳性表达率约为 60%70%左右。生殖细胞肿瘤中的AFP表达可见于单纯性内胚窦瘤和混合 性生殖细胞肿瘤，以及胚胎癌中的卵黄囊分化的区域。2.2甲状腺球蛋白（T

5、g）正常甲状腺滤泡上皮、滤泡胶质、所有类型的甲状腺腺瘤及甲状腺癌 均可有 Tg 的阳性表达。一般说来，高分化的甲状腺癌 Tg 阳性率最高，甲 状腺间变癌和巨细胞癌阳性率最低。甲状腺髓样癌一般Tg阴性。临床上甲 状腺癌首发症状常常表现为淋巴结或远处转移，Tg是一种确认转移性甲状 腺癌还是非转移性甲状腺癌的可靠标记。3 .检测肿瘤细胞增生标志物目前被广泛采用的两种增殖相关标志物是Ki-67及PCNA（增埴细胞核 抗原）。Ki-67与PCNA免疫反应性与细胞增生的形态学特征关系密切，特 别是与有丝分裂数及肿瘤分级相关。在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌 肝癌、胃癌和一些淋巴瘤及肉瘤，采用 Ki-67

6、与 PCNA 免疫组化分析，均 显示有增殖证据，提示这些肿瘤病人更容易进展。高 Ki-67 及 PCNA 标记 指数病人无病生存率及总生存率明显下降。4 检测癌基因产物和抑癌基因产物4.1 c-erbB-2c-erbB-2 过表达见于 2530%的原发性乳腺癌病例，并且仅限于癌细胞，而 不出现于正常乳腺上皮。c-erbB-2扩增与雌、孕激素受体表达呈负相关，与肿瘤 级别较高有关。 c-erbB-2 的过表达病人通常对常规辅助化疗反应性差，而这些病 例往往需通过改变化疗药物的类型来获得较好的疗效。4.2 生长因子及受体表皮生长因子受体（EGFR）广泛存在于各种组织中，但主要在上皮细胞上表 达，定

7、位于细胞膜或细胞浆。在许多肿瘤，EGFR的表达与肿瘤进展有关。大约 30%的乳腺癌表达EGFR，EGFR阳性病人的预后明显差于EGFR阴性病人且通 常对激素疗法不敏感。4.3P53p53基因改变是人类癌症中最常见的遗传学异常。已报道涉及许多人类肿瘤, 包括结肠癌、膀胱癌、 肺癌、乳腺癌和其他类型癌、星形细胞瘤、白血病、肉 瘤和间皮瘤等。越来越多的证据认为，至少在某些类型肿瘤，有p53改变的病人 总生存率较低。在许多肿瘤， P53 改变似乎是肿瘤发生的早期标志，可在原位癌（乳腺及膀胱）、不典型增生（前列腺及结肠癌）中检出。因此，进展危险极高 的肿瘤甚至可在出现浸润前即得以确认。5. 预测治疗反应

8、5.1 ER 和 PR免疫组化抗受体检测可预测乳腺癌对激素治疗的反应性。无 ER 或 PR 表达 的肿瘤对激素治疗通常反应性差，而 ER 及 PR 阳性肿瘤则对激素治疗反应性高。 5.2多药耐药（MDR）P 糖蛋白（ P-gp ）： P-gp 是一种跨膜蛋白，对化疗敏感的肿瘤通常 P-gp 表达 率低，对化疗耐受的肿瘤常有P-gp表达增强。检测P-gp表达有助于确定可能对 常规化疗耐药的肿瘤，从而提供适合于这些病人合理的替代治疗方法。6. 应用于临床病理诊断 许多肿瘤组织细胞在显微镜下看起来非常相似，以致于病理医生难以完全准 确地判断出肿瘤的性质。使用免疫组化检测肿瘤细胞的表面和细胞内特异性的

9、物 质表达，有助于明确肿瘤的性质和组织来源。附表 可用以下抗体对肿瘤进行分类筛选：A 癌： Cytokeratin+， Vinentin-， LCA-1、神经内分泌癌：Chr+, Syn+2、甲状腺癌： Thyroglobalin+， Calatonin+3、生殖细胞肿瘤： PLAP+， AFP+， HCG+4、消化道癌： CA242+， CEA+5、鳞癌：Cytokeratin+ （高分子量）6、腺癌：Cytokeratin+ （低分子量）7、乳腺癌、子宫内膜癌： ER+， PR+， C-erbB-2+8、肝癌： AFP+， AAT+9、前列腺癌： PsA+， PSAP+， AR+10、卵巢

10、癌： CA125+B 肉瘤： Vimentin+ ， Cytokeratin- ， LCA-1、恶黑： HMB45+， S-100+， Melon-A+，2 、肌源性肉瘤： HHF35 （ Actin ） +， Desmin+3 、平滑肌肉瘤： Actin（sm）+4 、横纹肌肉瘤： Myoglobin+， Myosin+ ， MyD1+5 、恶纤组： CD68+ ， Lysozyme+6 、滑膜肉瘤： Cytokeratin+7 、恶性间皮瘤： Calretinin+， Mesotheliol cell+8 、原始神经外胚瘤： CD99+ ， Neuroblestoma+9 、恶性神经鞘瘤，

11、脂肪肉瘤： S-100+10 、血管肉瘤： F8+ ， CD34+ ， CD31+第二节 免疫组织化学的实验操作及注意事项一、 免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS 缓冲液（pH7.27.4）： NaCl 137mmol/L, KC1 2.7mmol/L, Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB, pH6.0, 1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。3）0.5mol/L EDTA 缓冲液（pH8.0）： 700ml 水中溶解 186.1

12、gEDTA2H2O,用 10 mmol/L NaOH 调至pH8.0,加水至1000ml。4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至 pH8.0,加水至 1000ml。5） 酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8）配制。b、0.4%胃蛋白酶液： 用0.1N的HCl配制。6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。7）封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.09.5）等量混合；b、油和TBS（或PBS）配制。8）TBS/PBS pH9.09.5,适用于荧光显微镜标本；

13、pH7.07.4适合于光学显微镜标本。（三）、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60C恒温箱中烘烤20分钟。1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟；4）70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1 ）抗原热修复（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA （pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖 上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓 冲液中浸泡 5 分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10 分钟

14、后，去除热源，置入凉 水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（2）煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95C左右，放 入组织芯片加热1015分钟。（3）微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片 放入，断电，间隔510分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR, Bax, Bcl-2, C-fos, X-jun, C-kit， C-myc， E-cadherin， Chromogranin A， Cyclin， ER， Heat shock protein， HPV， Ki-67， MDMZ

15、， p53， p34， p16， p15， P-glycoprotein， PKC， PR， PCNA， ras， Rb， Topoismerase II等。2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37C,切 片也预热至37C，消化时间约为530分钟；胃蛋白酶消化37C时间为30分钟。适用于被 固定遮避的抗原,其中有： Collagen, Complement, Cytokeratin, C-erB-2, GFAP, LCA, LN等。3、免疫组织化学染色SP法1 ）脱蜡、水化；2）PBS洗23次各5分钟；3）3%H2O2 （80%甲醇）滴加在TMA上，室

16、温静置10分钟；4）PBS洗23次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗23次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。8）滴加I抗50p 1,室温静置1小时或者4C过夜或者37C1小时。9）4C过夜后需在37C复温45分钟。10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加II抗4050p l,室温静置，或37C1小时；12）II 抗中可加入 0.05%的 tween-20。13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB 显色510分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗1015分钟；18）脱水、透明、封片、镜

17、检。SABC 法1）脱蜡、水化。2）PBS 洗两次各 5 分钟。3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭510分钟，蒸馏水洗3次。4）抗原修复。5）PBS 洗 5 分钟。6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7）滴加I抗，室温1小时或者4C过夜或者37C1小时（4C过夜后在37C复温45分钟）。8）PBS 洗三次每次 2 分钟。9）滴加生物素化二抗,20C37C20分钟。10）PBC 洗 3 次每次 2 分钟。11）滴加试剂SABC, 20C37C20分钟。12）PBS 洗4次每次5 分钟。13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。1 4）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。 15）脱水、透明、封片、镜检。