组培常见问题

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1、植物组培过程中污染产生的原因及防治措施一、 污染的原因污染是指在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正 常生长和发育的现象。组织培养中污染是经常发生的，常见的污染病原是细菌和真菌两大类.细菌 污染常在接种1-2d后表现，培养基表面出现黏液状菌斑真菌污染一般在接种后3d以后才表现， 主要症状时培养基上出现绒毛状菌丝，然后形成不同颜色的孢子层。造成污染的原因也很多，主要有(1) 培养基及各种使用器具灭菌不彻底(2) 外植体消毒不彻底(3) 接种时不严格无菌操作(4) 接种和培养环境不清洁(5) 培养容器原因，包括盖子和封口膜等。二、 材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成

2、成批接种材料被细菌污染，操作人员不严格遵守无菌操 作规程也是造成细菌污染的重要原因。培养环境不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养容器的 口径过大以及封口膜破损等主要引起真菌污染。2 污染的预防措施2。1灭菌要彻底 在组培生产中，各种培养基以及接种过程中使用的各种器具都要严格灭菌。首先是培养基的 灭菌，耐高温的培养基需要在121-123C条件下灭菌2030min。若出现灭菌时间不足或温度不够, 培养一段时间后就会在培养基表面产生细菌性的污染。一些不耐高温的物质,可采取细菌过滤器除 去其中的微生物。其次,接种用的器具除了经过高温霉菌外，在接种的过程中，每使用1次后,都要 蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧

3、灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染。第三, 对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗。2。 2环境消毒不清洁的环境也会使培养的污染率明显增加，尤其是在夏季，高温高湿条件下污染率更高。 接种和培养环境要保持清洁，定期进行熏蒸或喷雾消毒。高锰酸钾和甲醛熏蒸效果好，但对人体有 一定的伤害，一般每年熏蒸2-3次。平时读接种室和培养室可采用紫外线照射消毒或喷2来苏尔 消毒。臭氧消毒机对环境消毒效果较好，而且使用灵活方便，对人体的伤害也相对较小。2.3严格无菌操作在接种时要严格无菌操作，避免人为因素造成污染。为了使超净工作台有效工作，防止操作 区域本身带菌，要

4、定期读一过滤器进行清洗和更换。对内部的过滤器，不必经常更换，但每隔一定 时间要检测操作区的带菌量,如果发现过滤器失败，则要整块更换.此外还需要测定操作区的风速, 通过调压旋钮使操作区的风速达到无菌操作需要的20-30m/min。植物组培过程中培养物的玻璃化及其防治方法当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，苗 体趋于透明，其茎、叶表面无蜡质，这种现象通常称为玻璃化。玻璃化为组培苗的生理失调症，它 的出现会使组培苗生长 缓慢、繁殖系数有所下降，玻璃化的嫩茎不宜诱导生根。1 导致玻璃化的主要因素： 材料差异，在不同的种类、品种间，组培苗的玻璃化程度有所差异. 激

5、素水平过高，若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，易引起玻璃化 现象。 培养基水势，培养基中离子种类，比例不适。 环境温度、光照强度和通气性。温度过低或过高,光照时间强度不足及培养容器中空气湿 度过高，透气性较差所造成的通气不良,易造成组培苗含水量高，从而发生玻璃化现象。 琼脂浓度降低、有杂质等。2常用的防治措施有 增加光照强度和光照时数。 降低细胞分裂素含量.在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落 酸等物质,能够在一定程度上 减轻玻璃化的现象发生 增大培养基中琼脂的含量，以降低培养基的水势 降低NH4+浓度，减少培养基中含氮化合物的用量 增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻组培

6、苗玻璃化的现象有明显的作用； 降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻组培苗玻璃化的现象发生;组培苗瘦弱或徒长的防治措施正常的组培苗应当叶色浓绿、植株粗壮。如果在增殖阶段出现芽苗瘦弱、徒长或节间过长，这种苗转入生根培养时能够生根，在环境条件较好的情况下，也会稍转粗壮，但总体看来，苗的 株型、叶色、叶片大小等性状还是差于生长正常的增殖苗；有时即便是正常或健壮的增殖苗，若生 根阶段培养基不适宜或培养的环境条件得不到保障，往往根原基及根还未形成，就很快表现出小苗 徒长，节间明显伸长，叶片变细、变薄、变嫩并出现黄化。这样的苗进行过渡培养时，会出现萎蔫和 烂根，很容易死亡，过渡成活率极低。对组培苗瘦弱的原

7、因分析如下。（1）细胞分裂素浓度过高，产生了过多的不定芽，这些密集的芽若不及时进行转移和分切， 很快就开始变成瘦弱苗。（2）温度过高，高温有利于苗的生长，多数品种适宜的温度是25C左右，在过高的温度条件下， 苗木的伸长速度快，叶片变薄、变长.（3）光照不足，组培苗会变黄、变弱、变细并加速生长，使苗在短时间内变得更瘦弱。（4）培养基水分过多，在琼脂含量不足会引起植株徒长变弱。（5）通气不良，在使用不透气膜时，会增加瓶内湿度，从而使苗表现嫩弱。以上因素同时出现时，对苗的不良影响明显大于单一因素，各个因素之间相互促进又相互制约.因此控制瘦弱苗，培养粗壮苗应通过多个因素共同调节才可能获得理想的效果。减

8、少和避免徒长和瘦弱苗的产生，可从以下几个方面考虑。（1）根据品种特点减少细胞分裂素用量，加速继代转瓶的速度，适当降低接种密度。（2）利用空调降低培养室温度。（3）提高光照强度和延长光照时间，充分利用较强的自然光做光源，调整摆放位置和密度.（4）调整培养基硬度，改用透气膜做封口，进行培养基及环境因子的综合调控，力求获得最优 质健壮的组培瓶苗.植物组织培养技术原理之灭菌方法常用的灭菌方法： 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热（烘烧和灼 烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲 洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰

9、酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌 素、酒精化学药品处理。1、湿热灭菌（培养基） 培养基在制备后的 24h 内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密 闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高 ,从而锅内温度也随之增 加在o.IMPa的压力下，锅内温度达121C。在此蒸气温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐 热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种 不同的做法,但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀， 通电后，待压力上升到O. 05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭

10、放气阀 关阀再通电后，压力表上升达到 01MPa 时压力 01-015MPa，20min。 对于一些布制品,如实 验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min.培养基中的 铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖培养基值小于5。5, 其水解量更多，培养基中添加0。1%活性炭时,高压下蔗糖水解大大增强，添加1活性炭，蔗糖水 解率可达 5%.防止高压灭菌培养基变化的方法：（1）经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，及时采取有效措施.（2）设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘

11、露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。（3）配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入.（4）注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6。48。而 96h 后又回降至 5.8 左右。2、灼烧灭菌（用于无菌操作的器械）在无菌操作时,把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精 中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广 口瓶，放入95%的酒精,以便插入工具。3、紫外线和熏蒸灭菌（空间）（1）紫外线灭菌 在接种室、超净

12、台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因 子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化,引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫 外线的波长为200一300nm,其中以260nm的杀菌能力最强,但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱， 所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。（2）熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中， 以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可.常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密,按 5-8mlm3 用量，将甲醛置于广口容器 中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可

13、预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸, 但效果不如甲醛。4、喷雾灭菌（物体表面）物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。褐变和玻璃化1、初代培养外植体的褐变外植体褐变是指在接种后,其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象 .它的出现 是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致 .在褐变过程中,会产生醌 类物质,它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性 ,从而影响所接种外植体的 培养。褐变的主要原因： 植物品种：研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异。 生理状态：由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一

14、般来说，处于幼 龄期的植物材料褐变程度较浅,而从已经成年的植株采收的外植体,由于含醌类物质较多，因此褐 变较为严重. 培养基成分：浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过 高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。 培养条件不当：如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从 而加速被培养的外植体的褐变程度。减轻褐变现象发生的方法 选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减 轻。 合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料 的褐变现象。 使用

15、抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免 或减轻很多外植体的褐变现象.另外，使用0.10。5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。 连续转移 对容易褐变的材料可间隔1224h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续 处理7lOd后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。2、继代培养时材料的玻璃化实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、 叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系 数有所下降。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚 乙烯醇、脱落酸等物质，能够在

16、一定程度上减轻玻璃化的现象发生。呈现玻璃化的试管苗，其茎、 叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽. 这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为： 增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势； 减少培养基中含氮化合物的用量; 增加光照； 增加容器通风，最好进行C02施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用； 降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生； 降低培养基中细胞分裂素含量,可以考虑加入适量脱落酸。组培苗瘦弱或徒长的防治措施正常的组培苗应当叶色浓绿、植株粗壮。如果在增殖阶段出现芽苗瘦

17、弱、徒长或节间过长，这种苗 转入生根培养时能够生根，在环境条件较好的情况下,也会稍转粗壮，但总体看来,苗的株型、叶色、 叶片大小等性状还是差于生长正常的增殖苗；有时即便是正常或健壮的增殖苗，若生根阶段培养基 不适宜或培养的环境条件得不到保障，往往根原基及根还未形成,就很快表现出小苗徒长，节间明 显伸长，叶片变细、变薄、变嫩并出现黄化。这样的苗进行过渡培养时，会出现萎蔫和烂根，很容 易死亡，过渡成活率极低.对组培苗瘦弱的原因分析如下.（1）细胞分裂素浓度过高，产生了过多的不定芽，这些密集的芽若不及时进行转移和分切，很快就 开始变成瘦弱苗.(2) 温度过高，高温有利于苗的生长，多数品种适宜的温度是

18、25C左右，在过高的温度条件下， 苗木的伸长速度快，对于一些有节间的品种如香石竹、满天星、菊花等,组培苗会变得特别瘦弱。 对一些无节间种类如非洲菊、勿忘我、情人草等的影响相对小一些，主要是叶片变薄、变长。(3) 光照不足，组培苗会变黄、变弱、变细并加速生长，使苗在短时间内变得更瘦弱。(4) 培养基水分过多，在琼脂含量不足会引起植株徒长变弱。但对于情人草这类生长速度慢，又 不容易引起玻璃化的种类，适当的高温高湿又可促进苗的快速生长。(5) 通气不良，在使用不透气膜时，会增加瓶内湿度，从而使苗表现嫩弱。 减少和避免徒长和瘦弱苗的产生，可从以下几个方面考虑.(1) 根据品种特点减少细胞分裂素用量，加速继代转瓶的速度，适当降低接种密度.(2) 利用空调降低培养室温度。(3) 提高光照强度和延长光照时间，充分利用较强的自然光做光源，调整摆放位置和密度.(4) 调整培养基硬度，改用透气膜做封口，进行培养基及环境因子的综合调控，力求获得最优质健 壮的组培瓶苗。