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1、一、甘油菌活化1. LB 培养基制备：胰蛋白胨 10g酵母提取物 5gNaCl10g加去离子水至800mL搅拌，使溶质完全溶解，用5mol/LNaOH （约0.2ml） 调节PH至7.4,加入去离子水至1000ml,高压蒸汽灭菌20min。灭菌后注意密封，4C能存放1个月。含琼脂的LB培养基：上述液体培养基高压灭菌前加入15g/L （铺制平板用）或7g/L （配制顶层琼 脂糖用）琼脂糖，高压灭菌 20min。2. 倒平板2.1 超净台，接种环，灭菌培养皿，酒精灯等紫外灭菌 30min。2.2培养基高压后放在60C水浴锅中保温。溶液尚未冷却时，即应取出培养 基，并轻轻转动以使溶解的琼脂或琼脂糖能
2、均匀分布于整个培养基溶液中。小心 培养基过热，旋动液体产生暴沸。2.3冷却至50C，在超净台中加入抗生素等不耐热的物质（现用现加），为 避免产生气泡，混匀培养基时应采用旋动的方式，然后直接从烧瓶中倾出培养基 铺制平板。2.4 从冰箱中取出甘油菌冻存管放在冰上，不要等到融化（反复冻溶不利于 长期保存），直接用（枪头）接种环在冻存管内的冰碴上蘸一下，然后马上涂平 板即可。37 C培养12-16h。第二天挑单克隆大量培养。3. 大量培养3.1冷藏的液态培养基重新高温高压湿热灭菌，待冷却至50C左右加入抗生 素。3.2在无菌操作台中将菌落挑至已加抗生素的液态培养基中（2-5mL）,37C, 200rp
3、m 培养 8h。3.3按1:500至1:1000的比例，用加抗生素的液态LB培养基稀释3.2所得 菌液。（25-50uL菌液+25mL液态含抗生素LB培养基）。37C, 200rpm培养12-16 小时。使密度达到3-4 10人9/mL。 OD600在0.5左右。（在可见分光光度计600nm处测菌液的光密度值,OD600 在 0.5 左右时可判断细胞处于对数生长期,活力最佳。）二、质粒提取1. 准备工作1.1 RNaseA 用前瞬离。一小瓶 RNaseA 加到 1 瓶 buffer P1 中，使终浓度为 100ug/mL。 Optional:按 1:1000 的比例，在 bufferPl 中加
4、入 LyseBlue。1.2检查buffer P2是否有沉淀（SDS,低温环境），如果有沉淀，将P2放置 37C条件下，以使沉淀溶解。1.3 4C预冷 bufferP3。2. 质粒提取2.1上述菌液，6000 g, 4C离心15min,收集沉淀。若不马上进行实验，沉淀可-20 C保存2.2用QIAGEN质粒提取试剂盒中的4mL buffer P1重悬。 为使裂解充分，容器要足够大，使充分混匀 确保 buffer P1 中已加入 RNaseA 如果 bufferP1 中 加了 LyseBlue， 重悬菌液之前， 应将混合液 （bufferP1+LyseBlue）用力混匀 涡旋或上下颠倒混匀，使重
5、悬菌液无团块2.3加入4mL buffer P2，颠倒混匀4-6次，室温（15-25C）静置反应5min。千万不可用振荡器混匀，会使DNA链断裂 静置时间不要超过 5min Buffer P2用后立即密封，以防空气中的CO2使其酸化 此时裂解菌液应是粘稠的如果buffer P1中加入了 LyseBlue，那么加入buffer P2并混匀后，应出现 均匀的蓝色，如果出现局部无色或棕色团块，应继续颠倒混匀2.4加入4mL预冷bufferP3，立即用力颠倒混匀4-6次，冰上静置15min。 注意低温操作（预冷，冰上静置），目的是促沉淀加入bufferP3后，出现白色蓬松状沉淀，沉淀为基因组DNA，蛋
6、白质， 细胞碎片，KDS。此时，裂解液粘稠度应降低如果buffer P1中加入了 LyseBlue，沉淀过滤后，溶液应该是无色的，表明 SDS 已经充分沉淀2.5离心前混匀，三20000xg, 4C离心30min。快速吸取上清（含质粒）。2.6上清20000xg, 4C离心15min。吸取上清。 Optional:取240uL上清，做凝胶电泳分析，以判断培养和分离是否合理2.7 平衡 QIAGENtip-100，向 QIAGENtip-100 中加入 4mL bufferQBT,重力 作用自然流下。2.8将2.6中的上清加入2.7平衡过的QIAGENtip-100中。提前平衡QIAGENtip
7、-100，使得上清尽快加入，如果间隔时间太久，（蛋 白沉淀变混浊）应再次离心以免堵塞 QIAGENtip-100 Optional:取 240uL流出的液体，做凝胶电泳分析，质粒DNA与QIAGEN 树脂的结合效率2.9 用 bufferQC 洗 QIAGENtip-100，一次 10mL，洗 2 次。 第一遍去除质粒提取试剂中的大部分杂质，如果菌液体积大或菌体产生 大量碳水化合物时第二遍清洗则必要的 Optional：2.10用5mLbufferQF洗脱DNA，用 15mL管收集洗脱液。 不可用聚碳酸酯离心管（不耐乙醇）如果重组质粒大于45-50kb，65C预热bufferQF可洗脱效率 Optional:洗脱下来的DNA可4C暂存，但不建议过夜2.11加3.5mL （0.7倍洗脱液体积）室温异丙醇沉淀质粒DNA，混匀，三 15000xg，4C离心30min,或者5000xg，4C离心60min。小心弃去液体。 室温异丙醇：减少盐沉淀 4C离心：防止样品过热2.12 用 2mL 室温 70%乙醇洗涤，15000xg, 4C离心 10min,或者 5000xg， 4C离心60min，小心弃去液体，室温晾干，用合适的缓冲液溶解（如TE buffer pH8.0,或 10mM TrisCl, pH8.5）。
甘油菌活化和质粒提取
