核酸分子杂交的原理和实验方法

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1、核酸分子杂交的原理和实验方法原理所谓 DNA 探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂 交。如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达 到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸 （hexanucleotide）作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 DIG-ll-dUTP作为合成底物，以 单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。以地高辛标记的 探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来 检测，就可以肯定杂交反应的存在。免

2、疫检测采用过氧化物酶系统， DAB 显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交 操作程序（l）随机引物标记操作程序如下： 用灭菌去离子蒸馏水稀释1 ug DNA至总体积16ulo DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分 钟以上。 加4卩l DIG Random Labeling Mix（高效）,混匀后再离心2000/r.p.mX 5分钟。 置37C反应至少120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20小时可明显增 加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。 加入2 u 1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应

3、可告结束，上述反应液置-20C保存至少一年以上。且可反复使用。可根据下表估计标记产量：DNA 模板量标记一小时标记二十小时10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng（2）核酸探针膜上杂交原理和操作（一）杂交总原则脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA的一级结构。两条碱基互补的多核苷 酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。某些条件（如酸碱、有机溶剂、加 热）可使氢键断裂，DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补顺序的

4、核酸 单链，DNA单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补原则结合成异源性双链的过程。（二）杂交膜的选择 杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电荷的膜和不带电荷的膜两种。带正电 荷的尼龙膜对核酸结合力强，敏感性也较高。不带电荷的膜结合力低，相应敏感性也较低。 尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液（0.1XSSC,0.1%SDS）煮沸5-10分钟后去除探针， 可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后 重新杂交。（三）探针浓度 探针浓度是获得理想杂交检测的关键因素，浓度太高则

5、会导致本底太深；若浓度太低又 会导致信号减弱。为了解决过高探针浓度所引起的高背景，必须进行模拟杂交实验。所谓模拟杂交实验，即选择几小片杂交膜，在未转移DNA的情况下，进行封闭、不同 浓度的探针孵育及随后的免疫检测。以背景能被接受的最高探针浓度为正式杂交实验的浓 度。模拟杂交实验不同浓度的探针可以参考下述方法配制：取5M标记反应液加lml探针 稀释液，混匀。取0.5ml等倍释后，再取0.5ml继续等倍稀释。假设20 M标记反应液中含 lug标记的探针，则系列稀释探针的浓度分别是：200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、 l2.5ng/ml、 6.25ng/ml。(四)

6、 预杂交和杂交液预杂交和杂交都使用相同缓冲液，不同的仅仅是预杂交液中不含有探针。下面是几种基 本杂交液配方： Standard buffer: 5 X SSC,0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。 Standard buffer+50% formamide :50% formamide(deionized),5 XSSC,0.1%(W/V)N-Lauroy lsarcosine,0.02% (w/v)SDS,2% Blocking Reagent。 High SDS buffer(Church buffe

7、r):7%SDS,50% formamide(deionized),5 X SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodium Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine(五) Southern BlottingDNA片段经电泳分离后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。1975年Southern发明了利 用浓盐溶液的推动作用将变性的单链DNA转移到硝酸纤维素膜上的方法，解决了原位转移 的问题。虽然其原理和操作均很简单，却是基因分析中必不可少的手段，已经得到了广泛的 应用。Southern印迹杂交包括两个主要步骤把电泳分级的DNA转移到固相支持膜上。 与标

8、记的 DNA 探针杂交。1 Southern 转移首先将DNA用限制性内切酶消化。准备一定浓度的琼脂凝胶。琼脂凝胶必须是高纯度 和核酸级的。电泳后经溴化乙锭染色并在紫外灯下照相后，将需要转移的琼脂糖凝胶切下， 放入搪瓷盘中，然后进行下面的步骤。试剂a. 0.25M HC1b. 变性液：0.5N NaoH,1.5M Nac1c. 中和度：0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1d. 20XSSC： 0.3M 柠檬酸钠,3M Nac1e. 2XSSC： 0.03M 柠檬酸钠,0.3M Nac1程序：(1) 将胶浸入0.25M HC1中10分钟。HC1处理的作用主要是通过去嘌吟使DNA

9、分 子断裂，因而有利于高分子量 DNA 的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于 10kb 的 DNA 片段时可省略此步骤。(2) 进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20-30分钟。(3) 把胶浸入变性液中，室温浸泡15分钟X2次。(4) 蒸馏水漂洗凝胶2次。(5) 把胶浸入中和液中，室温泡15分钟X2次。(6) 在处理凝胶的同时，切一张与胶同样大小的尼龙膜或硝酸纤维膜。硝酸纤维膜用 2X SSC 浸泡。剪两张Whatman3#滤纸和一叠吸水用的粗滤纸注意不能用手指直接触及膜面。(7) 准备转移用平器和支架，平器中放20XSSC。架子上搭滤纸桥使溶液能够虹吸上 来。(8) 依次放：处理好的凝胶，硝

10、酸纤维素膜，吸水滤纸，玻璃板，适量重物(500-1000g) 注意：要检查PH值，用硝纤膜时PHv9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部“绝缘”，气泡处的 DNA 难以被吸到硝酸纤维膜上。(9) 于室温转移12-20小时。(10) 取出转移膜，用2XSSC漂洗数次，以去掉可能粘附于膜上的凝胶。( 11 )固定：可选择下述方法之一进行 DNA 固定 紫外线固定：使用长波紫外线照射10-20分钟，简单漂洗后干燥备用。尼龙膜置+120C烘烤30分钟。硝纤膜置真空烤箱中，80C减压烘烤2-2.5小时，以避免硝纤膜自熔。若无真空烤箱, 亦可在普通烤箱中65-70C烘烤3-4小时，也能达到固定目的。固定

11、后，将膜封于塑料 袋中，保存于干燥处待杂交。注意事项 转移液的盐浓度对转移具有一定影响。应选择20XSSC快。10XSSC转移 速度较快，对于高分子量DNA(10Kb)效果比较理想。因此要根据不同目的选择适当的转 移液。 转移时不能移动上边重物，防止出现“重影”现象。 硝酸纤维膜对于0.5kb以下的小分子DNA结合不牢，转移时容易丢掉。要探测小片 时最好用尼龙膜。2 . Southern 印迹杂交杂交成功的关键因素之一在于选择杂交液。应通过预实验来选择 合适的杂交液。另一个比较重要的因素是标记探针的浓度，一般选择5-25ng/ml，应通过模 拟杂交实验来选择合适的探针浓度。试剂a. Stand

12、ard bufferb. Standard buffer+50% formamidec. High SDS bufferd. Wash Solution I:2XSSC,0.1%SDSe. Wash Solution II :0.5XSSC,0.1%SDS程序 将转移好的尼龙膜或硝纤膜装入塑料袋中，每边各留2-4mm空隙。灌注杂交液的一 边留1cm空隙。在角上剪开一个小口，灌注预杂交液，从切口处赶走气泡，用封膜机封口, 浸入水浴中。 根据所选择的不同预杂交液，采用不同的温度预杂交4-20小时：Standard buffer:预杂 交温度 65-68C， Standard buffer+50%

13、formamide:37-42C， High SDS buffer:37-42C。 使用双链DNA探针时，沸水浴10分钟以变性探针。然后迅速插入冰中。 按模拟杂交实验所确定的探针浓度将适量探针加入到预杂交液中，配成杂交液，一般浓度5-25ng/m 1。按每100cm2膜加入至少3.5ml配制杂交液。 使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16-20小时。 杂交结束后，取出杂交袋，剪开一个小口，将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20C 以备下次使用。这样至少可保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至95C10分钟以 变性探针。杂交液如含有50%甲酰胺，则在68C变性10分钟即可。 取出杂交膜，用

14、Wash Solution I洗5分钟X3次。 保温冲洗：用Wash Solution!于68C冲洗15分钟X2次。(六) DNA Dot Blotting此检测方法用于快速定性筛选DNA。样品可以是纯化DNA，也可以是细胞碎片PCR的DNA。预杂交和杂交方法与Southern基本一致，不同的仅是样品的处理不同。试剂：DNA dilution buffer : 10mM Tris-HCl； ImM EDTA,PH8.0； 50 U g/ml herring Sperm DNA程序 将样本DNA稀释成不同浓度。 将样本DNA于+95C水浴10分钟，迅速插入冰中。 取1 Ul点样至尼龙膜或硝纤膜上

15、。点样前先画上圆卷做记号。 用紫外线照射固定或+120C烘烤30分钟固定。其后杂交步骤Southern相同（七） DAB显色检测法试剂：a. .BiotinMouse Anti一Digoxin200卩1b. SABCPOD200卩1c. DAB Stock Solution5mld. 冲洗液：0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1, PH7.4。e. 封闭液：1% Blocking Reagent/0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1。f. 显色缓冲液：0.1M PBS,150mM Nacl,PH7.4。g. TE 缓冲液：10mM Tris,1mM EDTA,PH8.0

16、程序：1. 经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1 分钟。2. 用干净的杂交袋或平皿，封闭液室温封闭60分钟。3. 用冲洗液冲洗5分钟X 3次，每次100ml。4. 用封闭液（e）1： 1000-2000 稀释 BiotinMouse AntiDigoxin,例如 10 U l BiotinMouse AntiDigoxin加至10-20ml封闭液中（稀释液+4C可稳定24小时左右）。 将适量稀释抗体加入杂交袋中37C反应1-2小时。5. 用冲洗液冲洗5分钟X 3次，每次100ml。6. 用封闭液（e）1： 1000-2000 稀释 SABC，例如 10ulSABC 加至 10-20

17、ml 封 闭液中（稀释液+4C可稳定24小时左右）。将适量稀释SABC加入杂交袋中37C反应1-2小 时。7. 用冲洗液冲洗15分钟X3次，每次100ml。8. 按1： 40配制底物显色液：250 U l储备液加至10ml显色缓冲液中，用前 加最终浓度为0.03%的H2O2,室温显色530分钟左右。当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏 水洗以终止反应。结果可以进行照相记录。还有一种选择是让膜干燥保存。（3） 原位杂交所谓原位杂交是指在保存染色体、细胞或组织结构的前提下，用探针定位检查出相关基 因序列。结合免疫细胞化学，原位杂交可以揭示出基因在DNA、mRNA水平的表达。原位杂交技术最早Pardu

18、e and Gall和John etal。分别在1969年发现。最初，放射性标 记技术是唯一的方法，其使用受到明显限制。由于非放射性标记技术的简单、高敏感性，为 原位杂交技术广泛应用开避了道路。（一）染色体原位杂交的一般技术1 玻片准备为了展开染色体，酒精清洁玻片即可。但为了防止细胞和组织的脱落，必须用多聚赖氨 酸或 APES 处理玻片。2 固定 为了保存形态结构，生物材料都必须予以固定。染色体的固定比较简单，甲醇/乙酸固 定即已足够。如果是石蜡包埋组织，采用福尔马林固定。冰冻切片采用 4%甲醛或 Bouins 固定液固定 30 分钟。应予注意的是， DNA 和 RNA 虽然不和各种交联剂反应

19、。但包围 DNA.RNA 的各种蛋白质和交联剂反应后，就会遮盖住靶核苷酸。因此，必须采取各种增加 通透性的程序。3 玻片上材料的预处理a. 内源性酶的灭活如果用酶作为标记物，内源性酶必须预先予灭活。如过氧化物酶，可用1%H2O2/甲醇30 分钟处理。至于碱性磷酸酶，由于杂交过程的破坏，残余碱性磷酸酶的活力会完全消失。b. RNA酶的处理一DNA-DNA杂交时需要处理内源性RNA。内源性RNA的存在，会由于DNA-RNA的杂交而增加背景。处理方法：DNase-free RAase(100 卩 g/ml)/2 X SSC,37 C 孵育 60 分钟。(SSC=150mM Nac1,15mM Sod

20、ium Citrate,PH7.4)c. HC1 处理 用 200mM HC1 处理20-30分钟可以增加信/噪比值，其机理尚不清楚。可 能与蛋白的抽提和部分功能核苷酸片断的溶解有关。d. 去垢剂处理 在脂膜成分未被固定，脱水、包埋等程序抽提时，可以进一步使用去垢剂处理，如 TritonX-100,Sodium dodecyl Sulfate等，同样有助于原位杂交技术。e. 蛋白酶消化蛋白酶消化有助于增进探针和核苷酸之间的接触性。消化通常用蛋白酶K，溶于20mM Tris-HC1,2mM Cac12，PH7.4 ,37C 15-30分钟。蛋白酶K浓度依不同对象来确定。例如对染色体和核的分离部分

21、，可以用1 Ug/ml蛋白酶K。4 探针和靶基因的变性对染色体DNA的原位杂交，必需进行变性处理。热变性越来越常用，它不仅简单，而 且效果很好。对不同的杂交，应试验不同的时间和温度，以找到最佳的变性条件。热变性时，探针和靶基因可以同时变性。将探针加到玻片上，盖上盖玻片。玻片放到 80C，2分钟后取出冷却至37C。如果是组织切片，变性时间应达到80C10分钟。组织和 细胞mRNA的杂交则不需变性处理。5 杂交后的冲洗 标记探针能够和其序列具有部分同源性的基因非特异性的杂交。这类杂交分子的稳定性总是不及完全同源的杂交分子。分别用不同强度冲洗液可以有效地洗掉非特异杂交的/探针， 而保留特异杂交的探针

22、。冲洗液的强度可通过改变甲酰胺浓度、盐浓度和温度来控制。通常 用2XSSC+50%甲酰胺来冲洗。有时可用更高强度的冲洗液。总的来说，杂交时用高强度 缓冲液，冲洗时用低强度的冲洗液(盐浓度越低，甲酰胺浓度越高和温度越高，则冲洗强度 越大) 。6 免疫细胞化学 免疫细胞化学和常规方法一样，必须先进行非特异性的封闭处理。如探针为地高辛标记时，Tris-HC1缓冲液含“Blocking Reagent”。此外0.4M NaCl的加入也有助于降低背景。免 疫细胞化学中最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶。前者用 DAB 作显色剂。后者用 BCIP/NBT作显色剂，方法同膜上杂交。显色强度由显微镜下控制。7

23、 影响原位杂交的主要因素a. 探针长度：原位杂交和其它杂交方法不同，它要求较短的探针。因为探针越短，渗透 性越强，可以渗透至细胞内部和染色体。不同的杂交所允许的最小核苷酸如下述公式所计算：b. 探针浓度：浓度越高，则杂交速度越快。但过高的浓度也会使背景增加，因此，宜选 择可接受背景的最高探针浓度。c. 硫酸萄聚糖：在水溶液中，硫酸萄聚糖是高度水化物质，因此使得大分子（如探针）难 以接触到其结合水，相对浓度大大增加，杂交速度明显加快。d. 碱基错配：碱基错配会引起杂交速度及二倍体的稳定性下降。因此在严格的杂交条件下，可以阻止探针与靶基因的非特异结合。e. 冲洗条件8 杂交标准条件适于DNA探针l

24、OObp050%去离子甲酰胺O2XSSC050mM NaH2PO4/Na2HPO4, PH7.00 lmM EDTA0载体 DNA任选组合：lxDenhardtsdextran sulfate,l-l0%温度 37-42 C杂交时间： 5-l6 小时（二）组织切片的原位杂交目前，原位杂交已成病理学的一个有力工具，原位杂交可以用于诸如病毒，癌基因，基 因突变等领域的检查。尤其是非放射性标记探针技术，为更多的实验室广泛应用原位杂交创 造了条件。对福尔马林固定、石蜡包埋切片的原位杂交，关键是以下三个步骤 ： 靶DNA的暴露。这要靠精心设计的消化步骤。 DNA的变性和杂交。 杂交的分子的冲洗和检测。1

25、 探针的准备2 玻片的处理 去污剂浸泡一晚，大量自来水冲洗，然后用蒸留水清洗。 干燥之后，浸入丙酮中3分钟。 玻片移入 l： 50 丙酮稀释的 APES 溶液中，浸泡5 分钟。 玻片用蒸馏水略加清洗。干燥备用。处理后的玻片置干燥无尘环境可保存半年。玻片 也可用“多聚赖氨酸”处理。3 组织切片的准备 组织用常规4%中性缓冲甲醛溶液固定，石蜡包埋。 常规切片。切片捞于涂有粘片剂的玻片上。 切片处理：先置60C烘片30分钟。二甲苯脱蜡，逐级酒精至水清洗。 临用前配制蛋白酶K溶液：储备液：Proteinase K,10mg/ml H2O，小量分袋-20C保存。将储备液用TES稀释成100卩 g/mlo

26、 （TES=5mM Tris-HC1,10mM EDTA,10mM Nac1,PH7.4 ）每张切片用Proteinase k 20-30 u l 37C消化5-15分钟。消化过程中加盖硅化盖玻片， 并置湿盒中。注意消化对组织原位杂交是至关重要的。过度消化会导致切片消失殆尽，消化 不足则敏感性不够，因此应针对不同组织尝试不同的消化条件。4 杂交 蛋白K消化后，去除盖玻片。用4%甲醛4C固定5分钟。 蒸馏水洗5分钟。 让切片上水分滴下去，并在室温干燥5分钟。注意只能让切片上水份减少，不能让切 片完全干燥。每张切片加5-10 u l探针（大切片需相应增加）。 设立严格的对照组，每张切片加5-10

27、u l不加探针的杂交液。 切片上加硅化盖玻片，将玻片置+95C变性6分钟。 把玻片放到冰上 1 分钟。 切片置温盒，42C杂交3小时以上。如果方便，应杂交过夜。5 冲洗去掉盖玻片，按下述程序冲洗2XSSC洗5分钟X 2次（室温）0. 1XSSC 洗 10 分钟（42C）6 杂交分子的免疫检测 切片置于0. 1M TBS缓冲液中，PH7. 4 每张切片加20-40 u l封闭液：1%Blocking Reagont/0.1M TBS。室温反应15分钟。 用封闭液1: 1000稀释BiotinMouse AntiDigoxin,每张切片加20-50 u l稀释试剂，湿盒室温反应1-2小时。用0.

28、1M TBS洗5分钟X3次。 用封闭液1： 1000稀释SABC, 37C反应60分钟。0. 1M TBS洗10分钟X3次。 配显色剂：将DAB储备液用0. 1M PBS，PH7. 5缓冲液1： 20稀释。加最终为 0.03%H2O2。每张切片加50ul, 般显色5-30分钟。信号弱时显色延长。（三）细胞的原位杂交下面的程序是用标记DNA探针来检测培养细胞中的mRNA。其它类型的检测可以参照 此程序进行。1.细胞准备，固定和增加通透性注意：所有溶液都必须用RNase抑制剂处理。玻片用多聚赖氨酸处理。直接用5% CO2在玻片上培养细胞。所用培养基为无酚红 Dulbeccos 基础培养基。37CP

29、BS清洗细胞。然后用下述固定液室温固定 30分钟：4%甲醛，5%乙酸和0. 9%NaC1。室温PBS清洗固定细胞，用70%乙醇储存于4C杂交前用下述方法脱水: 70%，90%和100%乙醇；10%二甲苯；然后再用100%，90%，70%乙醇，最后PBS洗 二次。 用胃蛋白酶消化固定细胞：0.1%Pepsin/0.1N HC1,37C5-10分钟。 PBS洗5分钟后，1%甲醛固定10分钟。PBS洗。其余步骤参照组织切片程序实行。(4) 各种溶液的配制15mM Sodium Citrate PH7.0 300mM Sodium Citrate PH7.0 150mM Sodium Citrate

30、PH7.01 X SSC： 150mM Nacl, 20XSSC： 3M Nac1, 10XSSC： 1.5M Nac1 ,Washing Solution 2XSSC： 300mM Nac1, 30mM Sodium CitrateWashing Solution (k5SC : 0.5xSSC+0.1%SDSWashing Solu tion OSSC:0.1:SSC+0.1% SDSNLauroylsarcosine:10%(w/v)in St erile H20,f ilt ered t hrougla i0efil-0a4SDS 10%(w/v)in St erile H2O:f i

31、lt ered t hrough 45 0.i2 membraneDenaturation Solution(for Southern t:ra0n.s5fNerN)aoH,1.5M Nac1Neutralization Solution(for Sout i ern : tr0a. n5sMfeTr)i sHC 1 , 3M Nac1,PH7.4Blocking Reagent:加10g Blocking Reagen至 100ml 0. IM TBS , PH7 .4缓冲液中。搅拌以助溶解。 如果必要时，加 0. 1%DEPC(dimethylpyrocarbonate)。Standard

32、hybridizatidnuffer: 5xSSC,0.1 NTauroylsarcosin.02% SDS 1% Blocking ReagentStandard hybridization buffer+50% forman5i)d$SC ,50% deionized formamide,0.1% NLauroylsarcosine,0.02% SD,S 2% Blocking ReagentHigh SDS Concentration hybridization ：buff)SDS,50% deionizod formamide,反 SSC,2% Blocking Reagent,50m

33、M Sodium Phosphate, PH7,. 00. 1% NLauroylsarcosine 500ml High SDS hybridiza tion bu可按下述方法配制：100% deionized formamide250ipl 30 x SSC83ml , 1M sodium Phosphate,PH7.0 25ml 10% blocking solution100,ml10% NLauroylsarcosine 5ml将上述混合液倒入有35g SDS的烧瓶中通风橱)。搅伴促进溶解，最后加入灭菌水至 500ml。储存于-20Detection Washing buf：fe0r

34、.1M TrisHC1,0.15M NaC1,PH7.4Detection buff：er0.1M PBS,150mM Nac1,PH7.4TE buffe：r 10mM TrisHC, 1mM EDTA,PH8.0 。玻璃和塑料器皿的硅化：先将待硅化器皿放入玻璃真空干燥器中；加1ml二氧二甲基 硅烷于一小烧杯中，放入干燥器。将真空干燥器与真空泵相连。抽气至二氯二甲基硅烷沸腾。 关闭真空泵，保持干燥器的真空。1-2小时后，慢慢往干燥器内通气，取出器皿 180C烘烤 2小时，塑料器高压消毒，用前用水冲洗干净。使用注意事项 核酸探针的标记及杂交是一个很复杂的过程，步骤多耗时长，影响因素多。要想获得

35、理 想结果，每一步都应严格操作。下面几个问题尤其应予注意：无菌操作：标记和杂交的各种溶液应高压灭菌；含SDS，Tween20的溶液应在滤膜除菌 后加入其它溶液；使用灭菌吸头。使用干净平皿：每次用前必须严格清洗。 膜的操作：操作膜时戴无尘的手套；只用无齿镊操作膜的边缘。原位杂交：每步反应均应加盖硅化的盖玻片有关参考文献1. Rigby,P.W.J,et al.Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in nick translation with DNA Polymerase I.J.Mol.Biol.(1997)113:

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