枯草芽孢杆菌的发酵

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1、枯草芽孢杆菌的发酵枯草芽抱杆菌的发酵学院：化工学院 专业：生物工程 班级：生物10-2 姓名：姜霞摘要枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的 15种菌种之一 ,其已被 越来越多地制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染 的“绿色” 添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大 的社会效益和生态效益。通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽抱杆菌发酵的培 养基配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始pH值、 初始接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。在摇 瓶条件下优化发酵培养基和发酵工艺后，采用发酵罐进行发酵培养，对枯草芽

2、抱杆菌在液体发酵过程中的菌体数量、pH值、总糖含量和总氮含量四个因素 随时间的变化进行了观察。枯草芽抱杆菌，是芽抱杆菌属的一种。单个细胞0.708X23微米，着 色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽抱0609X1.01.5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽抱形成后菌体不膨大。菌落表面 粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽抱杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、 多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染 的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽抱杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造 成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值， 间接抑制

3、其它致病菌生长。枯草芽抱杆菌菌体自身合成a-淀粉酶、蛋白酶、脂 肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能 合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬 细胞的活性，在饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和 环境保护中。和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等关键词：枯草芽抱杆菌生长发酵活菌数第一章 材料与方法1.1 材料枯草芽孢杆菌1.1.2培养基(1) LB培养基：蛋白胨10g,酵母膏5g, NaClIOg，蒸馏水1000ml, pH为7, (可溶性淀粉20g)琼脂20g。(2) 筛选用培养基：含有2%可溶

4、性淀粉的LB培养基。(3) 种子培养基：豆饼粉 4%，玉米粉 3%，Na2 HPO 4 0. 8%，(NH 4)2 SO 4 0. 4%， NH4 Cl015%, H2 0。(4) 发酵培养基：豆饼粉 5.6%，玉米粉 7.2%, Na2 HPO4 0. 8%，(NH4) 2 SO4 0.4%, NH4C10.13%, CaCl20.13%, a淀粉酶 50g。1.1.3主要试剂蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、 尿素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化 钠和氯化钙。1.1.4仪器设备控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电子天平、pH测定仪、

5、无菌操作台和紫外分光光 度计。1.2方法1.2.1培养基的制备称量按培养基配比依次准确地称取酵母膏、NaCl、蛋白胨放入烧杯中，并在烧 杯中加入少量蒸馏水。注：酵母膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量, 用热水溶化后倒入烧杯，也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍 微加热，酵母膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。溶化可溶性淀粉溶液的配制方法：将所需克数的可溶性淀粉放入一个小烧杯中, 加入少量蒸馏水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均匀倒入少于培养基总体积的 沸水中，一边搅拌一边加热，待其溶化成透明状后继续在电炉上加热 5分即制 成可溶性淀粉溶液。如果配制固体培养基时，将已准备好的可溶性

6、淀粉溶液倒入烧杯中，将称 好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，补水到所需的总体积。在制备用三 角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然 后按2%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热 溶化同步进行，节省时间。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时， 需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不能用铜或铁锅加热溶化， 以免离子进入培养基中，影响细菌生长。调pH培养基配好以后，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴 管向培养基中逐滴加1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直 到pH达

7、7为止；反之，用1mol/LHCl进行调节。对于有些要求pH较精细的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。注意：pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度，配制pH 低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝 固，因此应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌， 再调整pH。分装按照实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶中。液体分装：分装的高度以试管高度的1/4左右为宜；分装三角瓶的量则根据需 要而定，一般以不超过三角瓶的一半为宜。固体分装：分装于试管中的应不超过试管的1/5,灭菌后制成斜面；分装三 角瓶的量以不超过一半为宜。加塞

8、培养基分装完毕后，在试管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌 时冷凝水润湿棉塞，外边再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称，组别， 配制日期。三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结扎好，使用时容易解开， 同样注明。(7)灭菌 将配置好且包扎完毕的固体、液体培养基及本实验涉及的试管、三角瓶等及400ml纯水于高压灭菌器中以014Mpa, 121C条件下高压蒸汽灭菌20分钟。(8)斜面搁置将培养基冷却至50C左右时放置斜面，斜面在试管的1/2处为宜，待斜面 凝固后，放置于冰箱中待用。倒平

9、板将实验配制好的培养基加热溶化，待冷却至5560C时，倒平板9皿。稀释用接种环取菌种，放入盛90ml无菌水的三角瓶中，振摇。用一支1ml无菌 吸管吸取1ml菌液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管 从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推 制成10 -1、10 -2、10 -3、10 -4、10 -5、10 -6不同稀释度的菌液。(3) 划线将平板底面分别用记号笔写上10 -4、10 -5、10 -6三种稀释度(共三组)然后 用接种环分别沾取浓度为10 -4、10 -5、10 -6稀释液并对号在相应平板上划线，室 温下静止510min，使菌液吸

10、附进培养基。培养将培养基平板倒置于37C的培养箱中，培养23天，观察淀粉圈。对有淀 粉圈的菌落，测量淀粉圈的直径D，菌落直径cp，计算丄的比值，可进行拍照， 选择淀粉圈较大的菌落作为后续实验的菌种。接种接种到斜面培养基中，标注上日期等信息。放入恒温培养箱中培养作为一 级种子。保藏斜面置于37C的培养箱中，培养23天，观察菌种长势好坏，若菌种长势 好则将其放入冰箱中保藏，若长势不好则需多次斜面转接。1.2.3枯草芽孢杆菌生长曲线测定（1）取12支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间即 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 和 23h。（2）接种用1ml无菌吸管吸取加l

11、枯草芽抱杆菌培养液（培养1012h）转入盛有100mlLB 液的三角瓶内，混合均匀。培养将已接种的三角瓶放置37C振荡培养（振荡频率为100r/min）分别在培养 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22和23h时，用无菌吸管吸取1ml菌液放入 标有相应时间的无菌试管中，立即放入冰箱中储存，最后一同比浊测定光密度 值。（4）比浊测定用无菌水作空白对照，选用660nm波长进行光电比浊测定，从早取出的培养液 开始依次测定，对细胞密度大的培养液用无菌水适当稀释后，使其光密度值在 0.10.65之内的生长情况。菌体进入对数生长期即可作为二级种子液用于分批 培养发酵实验。（测定P

12、H值前，将待测定的培养液震荡，使细胞均匀分布）。PH值测定结果培养时间（h）12345678PH值6.56.76.97.17.37.06.86.41.2.4菌种摇瓶培养(1) 称量根据需要量计算并依此称取豆饼粉、玉米粉、Na HPO、(NH ) SO、2 4 4 2 4 NH Cl放入三角瓶中，配成200ml溶液。4(2) 加塞包装。(3)灭菌接种 种。培养0 14Mpa, 121C,20min。接种前一级种子需先放在恒温培养箱活化(37匕、12h),冷却后接放入气浴恒温振荡器中37C,100r/min培养13h后，镜检，观察菌的生长情况。菌体进入对数生长期即可作为二级种子液用于分批培养发酵实

13、验。1.2.5产a淀粉酶枯草芽孢杆菌分批培养发酵(1) 称量根据需要量计算并依次称量豆饼粉.玉米粉、Na HPO、(NH ) SO、24424NH Cl、CaCl、a 一淀粉酶，放入发酵罐中加入蒸馏水配制2.5L发酵液。42(2) 灭菌 0.14Mpa, 121C,20mino接种(4)启动发酵罐，调节发酵系数，开始发酵。发酵参数：温度37C转速200r/min通气量1. 33VVm (012h)2.67VVm (12h发酵结束)pH值6.5测PH值，绘制生长曲线，并进行镜检，观察菌体生长状况。(6)发酵结束，放罐。第二章 结果与分析2.1 菌种筛选及保藏由于实验要筛选的菌种已经很纯了，所以此

14、次实验所提到的“筛选”，是要 筛选出有活力的、生长状态良好的纯种枯草芽抱杆菌。通过加入少量的可溶性 淀粉酶，可以使菌种进行选择性培养，这样筛选出来的菌株可以更好地产a 淀粉酶。筛选出来的菌种要进行保藏，此实验的保藏方法是放在冰箱中保藏。2.2扩大培养此次实验采用一次扩大培养，方法是摇瓶培养。扩大培养用的培养基与发 酵培养基相似。在气浴恒温振荡器中，发现摇瓶中变浑浊，而且表面有很多气 泡，这说明菌体开始生长了。培养特定时间后，生长出来的菌种就可以用于发 酵了。2.3发酵发酵采用的方式是分批培养发酵，在一切做好准备后，进行无菌操作，把 菌体放入发酵罐中进行发酵。整个过程都是需要时刻进行调节的，主要

15、的调节 项目为温度、pH值，因为菌体在生长的各个阶段，温度和pH都有所变化，而想 要生产出产品，就要控制好这两个参数。温度控制主要通过加冷却水来进行， 但要注意适量，不能太过。pH值的控制主要通过加氨水来调节，因为随着菌体 生长和产物产生，环境pH值会不断下降呈酸性，所以要不断加氨水来控制。第三章 结论枯草芽孢杆菌在培养过程中，由于培养条件掌握不好，常出现活菌数量低， 芽抱形成率低等问题。本研究通过一系列单因素实验,确定了枯草芽抱杆菌的最 佳发酵条件。通过对枯草芽抱杆菌进行筛选、扩大培养和发酵的控制，很好的 了解了生物产品生产的中游部分的各个步骤，初步学习了这几部分的主要注意 事项，尤其对发酵

16、有了一个初步的认识，学会了控制发酵的相关参数。通过测 量PH值，也了解了菌体的生长趋势。培养基优化方法多是在单因素水平试验的 基础上进行正交实验设计或是在正交试验基础上应用均匀设计理论，或者釆用 通用旋转组合设计，均能对培养基优化取得较好的效果。在工业化生产中，还 需要对接种量、pH、温度、转速、通风比、溶氧、以及消泡剂用量等一系列因 素进行严格控制，才能保证枯草芽抱杆菌发酵活菌数达到最高、发酵效果最好、 在动物饲料里的添加效果最理想。第四章 参考文献1吴玲，何颖.瑞士乳杆菌增菌培养基的筛选J常州工程职业技术学院 学报，Vol. 4 2007 December No. 54. 西北农林科技大学学报(自然科学版)，Vol.38 No7 Ju1 20103 冯宇，高年发，张颖.短乳杆菌生产Y -氨基丁酸培养基的优化J现代 食品科技,2010, Vol26, No14 张蕾，石新丽，李敏.短小芽抱杆菌TY079产抗菌物质的发酵培养基研究 N.河北省科学院学报，Vol. 27 No. 2 Jun. 2010.5 丁翠珍，裘季燕，刘伟成.枯草芽抱杆菌B02产生拮抗物质培养基及发酵 条件优化J中国生物防治，2008年5月. 吴永平，周景文，陈守文.枯草芽抱杆菌ME714产聚-Y -谷氨酸固态发酵 培养基的优化J应用与环境生物学报，2007，13 (5): 713716.