有关紫杉醇生产的影响因素与对策

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1、有关紫杉醇生产的影响因素与对策紫杉醇(Taxol)是从红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)植物树皮、针叶中分离出的一种四环二萜 酰胺类化合物, 它能有效地治疗晚期卵巢癌, 乳腺癌和其它癌症, 被称为是过去几十年中发现的最好的抗 癌药物。1992年12月29日，美国FDA正式批准紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌的新抗癌药物(商品名为 Paclitaxel)。由于紫杉醇在植物体中的含量相当低大约从36棵60100年生大树的树皮中才能提取到1g 紫杉醇，可治疗一个癌症患者。目前全球每年200kg紫杉醇的消耗量意味着要砍伐100万棵红豆杉大树，随 着紫杉醇应用范围的扩大，其需求量必然会逐年增加，

2、而红豆杉树生长速度相当慢，直径20cm的树需生长 100年! 因此, 伐树生产紫杉醇的方法不仅会严重破坏该树的长期生存和分布, 也根本无法满足人们对紫 杉醇的需求。尖锐的供需矛盾在医学、化学和生物学领域中引起了一场非同寻常的广泛研究, 以增加这种 化合物的来源。目前生产紫杉醇的主要方法紫杉醇的生产方法主要是提取分离和化学合成，提取分离的方法按来源不同又可分为三大类: 从植物中 分离提取、从真菌中分离提取及从培养细胞中分离提取。1.1 直接从红豆杉科植物中分离提取紫杉醇含量与种、部位、生长年限、生长环境等因素有关。在所有红豆杉中短叶红豆杉中紫杉醇含量 最高；从生长时间上看，生长时间越长的器官或组

3、织紫杉醇含量越高；从生长环境上看，生长在阴处的树 皮比暴露在日光下的高；就部位来看，一般树皮中紫杉醇含量较高，短叶红豆杉树皮中紫杉醇含量可达 0.069%。据估算，从20003 000棵稀有的紫杉树皮中只能提取1 kg紫杉醇，而对1例病人制备充足的药物需 3 4棵百年的老红豆杉树。 这要求人工栽培的红豆杉品种紫杉醇含量高、生长迅速。目前， 曼地亚红豆杉能相对较好地满足这些要求，它是一个杂交品种，生长迅速35day后可收获两次枝叶，其针叶中紫杉醇含 量为0.017% 0.046%。 因此， 人工种植该品种生产紫杉醇的成本不会低， 但是， 选育优良品种提取紫杉醇 无疑是一个有价值的研究方向。1.2

4、 直接从紫杉醇产生菌中提取紫杉醇产生菌主要是一些红豆杉的内生真菌。 真菌中最高紫杉醇含量为185.4 g/ L， 可见， 当前利用微 生物发酵方法产生紫杉醇的量很低， 难以达到工业化生产的要求。 而且， 真菌自身合成紫杉醇的途径还未 见报道， 自身是否存在紫杉醇的合成途径还需进一步研究探索。 此生产方法的前景还不明朗。1.3 化学合成法化学合成是生产药物的一条重要途径， 许多天然药物(如一些抗生素) 除了可从生物体内提取外， 还可 通过化学的方法合成。 紫杉醇的药效被发现以来， 其化学合成的方法一直受到重视并得到很多的研究探索。 迄今为止， 在生产上有价值的紫杉醇的全合成尚未取得成功。 紫杉醇

5、结构复杂， 母核有9个手性中心， 因此 应有2 048个非对映异构体，紫杉醇的半合成是以天然来源的baccatin或10-去乙酰baccatin为原料，通过13 位酯化得到紫杉醇或其它半合成衍生物。此法首先合成侧链.然后把侧链接到baccatin或10-去乙酰baccatin 上去。 紫杉醇的半合成法的问题主要在于：1) 合成原料在植物中含量不高， 分离成本较高。 2) 每一步反 应得率低， 而且有时会碰到选择性较差的问题。 所以， 无论是全合成还是半合成目前都取得了成功， 但都 难以应用于大规模的工业化生产。1, 4 利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇大规模地培养微生物细胞实现了许多种抗生素的大量

6、生产， 极好地满足了病人对抗生素的需求， 挽救 了无数人的生命。 抗生素是微生物的次生代谢产物， 紫杉醇是植物细胞的次生代谢产物， 能否通过大规模 的植物细胞培养大量获取紫杉醇很有研究价值。就现有的报道来看，这一生产方法受到了许多学者的重视， 许多研究者在高产细胞系的选择和代谢调控方面进行了大量的卓有成效的研究。影响紫杉醇生产的几个因素：1.碳源 碳源作为植物生长的基质和能量来源，对细胞生长和次级代谢产物的生产有很大影响。在短叶红豆杉 细胞悬浮培养中，比较了 20g/L的蔗糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、果糖对细胞生长的影响，发现半乳糖和蔗 糖最有利于细胞生长。在高起始糖浓度的培养基中，果糖最能刺激

7、紫杉醇的合成。与高起始糖浓度培养的 细胞相比，采用补糖的方法，紫杉醇产量在静止期可显著增加。南方红豆杉细胞对蔗糖的消耗有一个临界 点，即培养液中总残留有1g/L的蔗糖不能被吸收，而培养液中浓度为30g/L的蔗糖对细胞生长和产物合成最 为有利。蔗糖大部分被降解成葡萄糖和果糖，其中葡萄糖有利于细胞的前期生长以获得大量的悬浮细胞， 在中期添加果糖有利于细胞培养后期合成紫杉烷类化合物。2. 氮源在氮源组成中，较低的NH/NO比有利于细胞的快速生长，而其他无机盐浓度与细胞生长之间不存在这种43关系。培养基中咼浓度的NO有利于云南红豆杉愈伤组织的生长，而咼浓度的NH则抑制愈伤组织的生长，但34 可显著提咼

8、紫杉醇的含量。在无机氮全部为铵态氮的处理中，愈伤组织接种1周后就变成砖红色，增殖较少， 其生长指数显著低于对照，但紫杉醇含量较对照咼1倍。3. 光照 在离体无菌培养条件下，细胞处于异养状态，且培养基中已经添加了足够的碳源，光照并非用来提供光合作用的能量，但是不同的光照时间和光照强度仍然会对细胞代谢产生一定的影响。白光对东北红豆杉 愈伤组织和悬浮培养细胞中紫杉醇积累的影响发现，暗培养时悬浮细胞的生长量是白光培养下的2-3倍，紫 杉醇的产量也是白光培养下的3倍。其原因可能有2个：一是紫杉醇(二萜)的远程前体是甲戊二羟酸(MVA), 而MVA的合成量与甲戊二羟酸酰辅酶A还原酶(HMGR)的活性正相关

9、，光照会导致HMGR的活性降低，最终导致 紫杉醇积累的降低；二是光照会抑制紫杉醇的胞外分泌，从而可能导致胞内合成过程的反馈性抑制。4. 温度虽然大多数植物细胞的适宜生长温度范围较宽(22-30C)，但在红豆杉细胞生长和紫杉醇合成过程中， 适宜温度还是起着一定作用。低温处理对红豆杉细胞悬浮培养的影响，比较了分别在2、4、6、8C下处理 12,24, 36h以及恢复12,24, 36h对红豆杉细胞分裂指数的影响。结果表明，在2C下处理12H，恢复12h红豆 杉细胞分裂指数提高了 115%，说明低温对其细胞生长具有诱导作用。中国红豆杉在24C下培养一段时间后， 升高温度至29C，再培养14-21d时

10、，紫杉醇含量可达到137.5mg/L,如果21d后仍持续保持29C，紫杉醇含 量可在这一峰值保持42d，由此可见，温度与紫杉醇合成途径之间有明显的相关性。5. pH 值培养基pH值在4.87.8时，东北红豆杉愈伤组织的生长没有明显差异。但是培养基dH值对东北红豆杉和 南方红豆杉愈伤组织生长、紫杉醇含量与苯丙氨酸解氨酶活性的影响后，pH值的高低对红豆杉愈伤组织生 长及紫杉醇含量影响很大，且PAL活性的大小与紫杉醇含量呈正相关。即PAL活性高，紫杉醇含量往往也高。 这可能是因为：在PAL的作用下，由苯丙氨酸脱氨基而形成的肉桂酸参与了Win tersein酸的形成，而 Wint ersein酸是紫杉

11、醇合成的前体。值得注意的是，有利于愈伤组织生长的aH值却不利于紫杉醇的积累，而 且往往是愈伤组织生长越好,紫杉醇含量越低;生长状态较差的,紫杉醇含量反而可能增高。6. 气体植物细胞在悬浮培养时需要氧气02,同时也能非光合地固定一定浓度的二氧化碳，只有02和CO2的浓度达 到某一平衡点时,细胞才会很好地生长，乙烯是植物细胞在不良刺激下产生的一种防御性气体,对紫杉醇产 量的提高不利。对于浆果红豆杉的悬浮培养细胞，在培养基中维持低浓度的02并移走乙烯，同时提供充足 的0能够促进细胞生长，增加紫杉醇的产量。 扩大紫杉醇资源的途径主要有以下几个：一、进行红豆杉树木的扦插、育苗通过优株选择、品系匹配、控制

12、授粉进行良种选育, 繁育出高生长量、高紫杉醇含量的杂交种苗。南 方红豆杉具有的高生物量性状与北方红豆杉具有的高抗逆性状和紫杉醇高含量性状通过种间杂交组合, 有 望提高原料植物的紫杉醇生产力。研究表明，对红豆杉采用营养袋作基质，用ABT生根粉浸基部12小时， 在室外常规管理下, 生根率高达70%90%，且扦插苗根系发达, 占用土地少, 便于管理, 移栽成活率高。二、进行紫杉醇的化学合成与半合成全合成紫杉醇。一般采用两种合成途径, 一种是线性合成法, 另一种是收敛途径。两种途径均需要 2530 步复杂的化学反应过程, 若实现工业化生产紫杉醇, 还有一定的距离。半合成紫杉醇。主要是从红 豆杉的针叶中

13、获得高含量的10-去乙酰浆果赤霉素III,以此为原料半合成紫杉醇以及同系物 taxotere, taxotere的抗肿瘤作用与紫杉醇相似。在临床试验中，采用taxotere治疗晚期肿瘤患者，有效 率达40%。由于红豆杉针叶产量大、再生能力强， 因此， 半合成紫杉醇的原料是很丰富的。三、进行紫杉醇的组织培养近年来， 国内外进行愈伤组织培养的红豆杉或变种已超过10 个， 其中大部分被证实可产生紫杉醇。研 究较集中的是欧洲红豆杉、太平洋红豆杉、东北红豆杉等， 选作诱导愈伤组织的外植体包括根、茎、叶、 树皮、形成层、大配子体、种子胚、假种皮、幼苗胚轴等。还有人用发农杆菌转化红豆杉细胞离体培养生 产紫杉

14、醇及其类似物， 诱导其发根， 然后大量培养发根， 从发根中提取紫杉醇。由于发根速度较快， 且遗 传性状稳定， 有望成为工业化生产紫杉醇的一条新途径。四、进行紫杉醇的细胞培养自1989年首次利用细胞培养技术生产紫杉醇后， 红豆杉细胞悬浮培养的研究报告呈逐年增加趋势， 研 究范围涉及细胞株系的选择， 细胞生长、紫杉醇生产及营养成分消耗的动力学、诱导物、菌体、激素的种 类和浓度、糖的种类和浓度、生物过程的偶合、生物反应器的种类、培养环境等方面的内容。目前利用细 胞培养技术生产紫杉醇的研究已经进入到生物反应器放大阶段。五、进行紫杉醇产生菌的工程菌株构建与发酵生产利用生物技术合成紫杉醇是近年来国内外的研

15、究热点。其中微生物生产紫杉醇的研究取得了突破性进 展， 但就目前水平来说， 还达不到工业化生产的要求。微生物发酵法生产紫杉醇的关键问题是紫杉醇产生 菌的分离和发酵液中紫杉醇产量的提高， 这也是构建工程菌株的关键， 目前还有许多关键技术问题需要解 决。研究者认为有两个设想是可行的: 其一是从红豆杉中分离紫杉醇基因组， 将其转移到真菌中， 使其稳 定地提高紫杉醇的含量。因为在许多植物微生物共生系统中， 宿主植物中某些微量的化合物对微生物 产生目的产物是必不可少的， 它可以启动微生物中某些遗传机能， 促进目的产物的合成。相信在不久的将来， 选取优良的紫杉醇产生菌为出发菌株， 通过诱变育种、细胞工程或基因工程手段进行改造， 从而筛选得到 高产工程菌株用于工业化生产， 可以彻底解决紫杉醇资源的危机。