免疫组化步骤

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1、免疫组化流程1、固定灌流后尽快取出肾脏（1-2分钟内完成），剥除筋膜和其他结缔组织，取皮质削成薄片，（易于固定液的浸透），臵于DwbosyBra液24小时，按照D程序转缸。2、包埋蜡块皮质朝下，组织放平3、切片切2-3微米，用多聚赖氨酸处理的玻片捞组织，用吹风机吹熔组织。如暂时不做，放-20冻存，室温放臵过久，抗原会丢失4.烤片：烤箱601小时后尽快放入二甲苯缸脱蜡5.脱蜡及水化：二甲苯1二甲苯2-二甲苯3-无水乙醇-90%乙醇-75%乙醇，每缸10分钟6.抗原修复先用微波炉将缓冲液中火3分钟煮沸，再将片子臵入，低火10-20分钟修复抗原3%H0室温孵育10分钟，PBST3min洗三次22羊血

2、清室温孵育15分钟，不洗一抗4过夜，PBST3min洗三次生物素化的二抗15分钟，PBST3min洗三次亲和素链霉素过氧化物酶复合物即“三抗”15分钟，PBST3min洗三次DAB显色核复染苏木素5min盐酸酒精lmin氨水5min，染完冲水，风干中性树胶封片，37烘片2小时建议：1、全程尽可能减少干片的机会，以降低非特异性染色2、抗原修复应在HO之后，以便高温时进一步脱蜡22重要步骤说明：1、标本固定固定的目的：1）保持组织细胞原有的形态结构2）使组织硬化固定的优、缺点：优点：使组织细胞的形态结构得到保持缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损2、脱蜡及水化这是为了后面的抗体等试剂能够充分与

3、组织中抗原等结合反应。水化用梯度乙醇（由高到低即无水乙醇-90%-75%）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。3、抗原修复抗原修复的原因：固定液中的醛基与抗原蛋白的氨基酸残基交联形成羧甲基,使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍,再则由于分子间的交联形成的网格结构,可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露,这些均可造成假阴性的染色结果。因此,用醛类固定剂固定的组织,除非特殊说明,均应常规做抗原复。修复方法：常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。需要根据抗体说明书的要求，选择最为合适的修复方法。我们选用的抗体一般用PH6.0柠檬

4、酸盐缓冲液微波修复。注意微波修复后自然冷却30min左右（修复液的温度达室温即可）。4、细胞组织通透目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用。在免疫组织化学（10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。5、灭活内源性过氧化物酶和生物素在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性P

5、OD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般1030min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用。过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。6、血清封闭组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。7、抗体的孵育一抗孵育条件很重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4、室温、37，其中4效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般371-

6、2h，4过夜。二抗孵育条件：二抗一般室温或3730min-1h或者遵照试剂盒说明。8、抗体稀释其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。9、切片清洗为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，此外PBS+Tween-20能增强洗涤效果的同时，还能使切片不容易干片,而且能节省试剂。（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。（3）冲洗的时间足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。建

7、议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。中性及弱碱性条件（PH7-8）有利免疫复合物的形成，而酸性条件则有利其分解；低离子强度有利免疫复合物的形成，而高离子强度则有利其分解。10、DAB显色背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，由显微镜下控制显色时间，到显特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗。DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就显出很深的棕褐色，这很可能说明抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间；此外，若很短时间就出背景很深，还有可能前面的封闭非特异性蛋白不全，需延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳

8、性染色，一方面可能说明抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4过夜）；另一方面就是封闭时间过长。11、核复染目的显出组织轮廓，从而更好地对目的蛋白进行定位，经常用苏木素复染。苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目的抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则应短一些。染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再臵于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后臵于盐酸酒精中数秒（一定动作作快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰。12、封片为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然

9、后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。封完片以后，若发现仍有气泡，可放在平整放臵在37温箱2小时，以利于气泡的排出。常用试剂的配制1、PBST缓冲液（pH7.27.4）：NaCl8g,KC10.2g,NaHPO423.57gKHPO40.2g）Tween-201ml,双蒸水1000ml,充分溶解后2调PH至7.4.2、0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB,pH6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g,双蒸水1000ml，充分溶解后调PH至6.0.3、0.5mol/LEDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTAH2O,用10mmol/LNaOH调至pH8.0,加水至1000ml.充分溶解后调PH至8.0.