免疫组化试验方法

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1、免疫组化试验方法编辑整理：雷小灿2013/10/15）1. 一、主要步骤一）溶液试剂的配制二）石蜡切片的免疫组化处理三）冰冻切片的免疫组化处理二四）、免具疫组体化实试验验步操骤作步骤一）溶液试剂的配制lxPBS:Na2HPO412.32g,NaH2PO41.12g,NaCl3.4g,溶于400mlDEPC水，定容至500ml,高压灭菌。PBST即1LPBS加1mlTween-20即可。3%甲醇双氧水：吸取10ml30%的双氧水，加入90ml100%纯甲醇，即为3%甲醇双氧水檬酸溶于1000ml的蒸馏水中。2. pH6.0柠檬酸钠抗原修复液：A液：0.1M柠檬酸缓冲液：称取21.01g柠酸钠溶于

2、1000ml的蒸馏水中。B液：0.1M柠檬酸钠缓冲液：称取29.41g柠檬酸溶于1000ml的蒸馏水中。工作液：取9mlA液和41mlB液,加入450ml蒸馏水中,pH值即为6.0。苏木精染液：I铵钒30g,蒸馏水400ml,II苏木素4g,纯乙醇25ml,III甘油100ml,甲醇100ml。（亦可购买使用）配法：1）将铵钒直言播种捣碎，溶于400ml蒸馏水中，加温至4050C。2）将苏木素溶解于纯乙醇中,充分振摇使其完全溶解。3）I与II混合导入玻璃瓶中，置于光线充足处，一周后过滤。4）将甘油和甲醇加入到过滤好的I和II混合液中，盖好瓶塞，外包黑纸，置于室温较低处使其成熟,成熟后的苏木精为

3、紫黑,成熟时间约为12月。3. 不同浓度酒精的配制：用蒸馏水和纯酒精配制70%酒精，85%酒精，90%酒精，95%酒精，100%酒精，100%酒精：二甲苯=1:1，二甲苯。1. 二）石蜡切片的免疫组化处理脱蜡之前防脱：取APES2ml加入到98ml纯丙酮中混匀，之后将切片放入进去作用2min，之后于纯丙酮中洗去APES，风干即可进行脱蜡。注：1. 切片在APES中作用90s时开始移至纯丙酮中作用30s。2. 丙酮有一定的刺激性气味，操作时尽量带上口罩。3. 盛丙酮的容器尽量擦干，如有水的存在会影响防脱效果。2. 脱蜡至水：二甲苯IlOmin,二甲苯IIlOmin,二甲苯：100%酒精=1:1l

4、Omin,100%酒精I8min,100%酒精II8min,95%酒精5min,90%酒精5min,85%酒精5min,70%酒精5min,水2min。3. 脱蜡之后防脱：取APES2ml加入到98ml纯丙酮中混匀，之后将切片放入进去，作用2min,之后于纯丙酮中洗去APES,风干即可进行下一步试验。注：1. 此次防脱之前一样要等切片上的水干掉之后才可以进行防脱，跟之前防脱操作方法一致。三）冰冻切片的免疫组化处理冰冻切片机预冷：至少提前2h打开冰冻切片机，使其机内温度提前降低到-24-25C。1. 取材：卵巢样品的选择：选取卵巢表面卵泡均匀，卵泡直径不大于2mm的卵巢，修剪为1.5*1.5cm

5、*0.5cm形状。2. 组织冰冻：将取好的卵巢组织冰冻切片机样品板上，用冰冻切片包埋剂包埋，之后放于冰冻切片机中冰冻2h以上。3. 切片，在冰冻切片机中，切成7-10微米的切片，贴于载玻片上。4. 烤片，将切好的冰冻切片于45C烘箱中烘干1h。5. 防脱，取APES2ml加入到98ml纯丙酮中混匀，之后将切片放入进去，作用2min,之后于纯丙酮中洗去APES，风干即可进行下一步试验。注：1. 取材方法根据石蜡切片的方法进行。2. 取好材料可以直接用冰冻切片包埋剂直接黏贴于底座上，放入冰冻切片机进行冰冻。3. 在利用冰冻切片包埋剂包埋组织时，不需要过多，能固定住组织防止其脱落即可。1. 四）免疫

6、组化试验步骤室温下，摇床上，切片于PBS-TWeen-20中洗涤3*5min。2. 室温下，于水平摇床上（100rpm/min）,3%的电02-甲醇（取市售30%的电0220ml，加甲醇至200ml即为3%的H2O2-甲醇，即用甲醇稀释10倍冲作用30min,以灭活内源性过氧化物酶。注：根据切片的数量来稀释H2O2的用量，一般一个缸100ml足够。3. 同1，同时配制700ml的pH6.0的柠檬酸钠缓冲液于格兰仕微波炉中90%的火力，lOmin预热。4. 于微波炉中，将切片臵于染色架，于pH6.0柠檬酸钠缓冲液中90%的火力，作用三次，每次6min,其中中间都停顿5min,之后取出冷却至室温。

7、注：1）最后一次最好在室温下让其自然冷却至室温，切勿用冷水或冰上冷却。2）由于在微波修复过程中会因沸腾而使液体逸出减少，液体浸没不过切片，影响后续实验，因此配制柠檬酸钠修复液时可多配些，一般一次配1000m1,预留补充。5. 重复第一步。6. 室温下，于水平摇床上（100rpm/min），切片于1%TritonX-100-PBS-TWeen-20中作用30min。注：1）TritonX-100用PBS-Tween-20稀释100倍，现用现配；2）因TritonX-100比较粘稠,用枪头缓慢吸取或者吸取前可以先剪一下枪头再吸取。7. 重复第一步。8. 从PBS-TWeen-20中拿出切片,擦干周

8、围液体,用免疫组化笔在切片周围画上圈，之后在切片上滴加5%BSA，室温下封闭45min。注：1）用免疫组化笔画圈时,一定要擦干周围的水,否则免疫组化笔划到水画不出,且会损坏笔。免疫组化笔很贵哦,500多一支呢！请爱惜！2）每个1平方厘米的切片上滴加的液体量大约为50-100微升即可。3）切片放在孵育湿盒的时候要放平,防止液体流出。一抗二抗的时候也一样。4）在转移孵育湿盒的时候也一并要将湿盒托稳,托平。9. 倒掉封闭液，用PBS-TWeen-20按照比例稀释一抗，将一抗滴加到载玻片上,于4C冰箱孵育过夜。10. 倒掉一抗,重复第一步。11. 从PBS-TWeen-20中拿出切片,擦干周围液体,按

9、照比例稀释二抗,将二抗滴加到载玻片上，室温孵育45min,再移至37C温箱孵育45min。12. 倒掉二抗,重复第一步。13. 从PBS-TWeen-20中拿出切片，擦干周围液体，按照比例稀释HRP标记的链酶蛋白亲和素，37C温箱孵育45min。14. 倒掉HRP标记的链酶蛋白亲和素，重复第一步。15. 于黑暗避光条件下,按照DAB显色试剂盒配制显色液,将显色液滴加到载玻片上，显色，肉眼观察有颜色呈现时，倒掉显色液，PBS-TWeen-20或一蒸水终止显色。16. 重复第一步。17. 将切片置于苏木精中复染5min,之后水洗，1%盐酸酒精分化1-2s，流水冲洗20min返蓝。18梯度酒精脱水，70%酒精5min，85%酒精5min，90%酒精5min，95%酒精8min,100%酒精I10min,100%酒精II10min,100%酒精：二甲苯=1:110min,二甲苯I10min,二甲苯II10min。19.中性树胶封片，镜检。注：1）使用树胶之前，先用二甲苯对其进行1:1稀释。2）因树胶凝固后很难清洗，包括在手上，切勿将树胶洒落于载玻片之外的任何区域，如不小心洒落，可用二甲苯对其进行涂擦消除。3）二甲苯属于有毒物质，请小心使用。