血清学反应试验

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1、血清学试验血清学试验血清学试验血清学鉴定：用已知抗体鉴定未知的细菌或标本中的抗原血清学诊断：用已知抗原检测血清中的特异性抗体抗原（antigen）是一类能刺激人或动物机体产生抗体或致敏是一类能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞（免疫原性），并能与这些产物在淋巴细胞（免疫原性），并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质（反应原体内或体外发生特异性反应的物质（反应原性）。性）。（一）抗原的性质（一）抗原的性质1.1.异物性异物性异种间的物质异种间的物质同种异体间的物质同种异体间的物质眼睛水晶体蛋白质、精眼睛水晶体蛋白质、精 细胞及甲状腺球蛋白等细胞及甲状腺球蛋白等自体内隔绝物质：自体内隔

2、绝物质：抗原的性质抗原的性质3.3.立体化学结构：一般分子结构和空间构象愈复杂立体化学结构：一般分子结构和空间构象愈复杂的物质，免疫原性愈强。的物质，免疫原性愈强。4.4.抗原决定族抗原决定族antigenic determinant(antigenic determinant(抗原分子表抗原分子表面上的具有一定化学组成和结构的特殊化学基团面上的具有一定化学组成和结构的特殊化学基团)决定其特异性决定其特异性2.2.分子量足够大：一般分子量足够大：一般10104 4道尔顿道尔顿抗原决定族人工抗原人工抗原天然抗原天然抗原合成抗原合成抗原异种抗原异种抗原同种异体抗原同种异体抗原自身抗原自身抗原核酸抗

3、原核酸抗原蛋白质抗原蛋白质抗原脂抗原脂抗原多糖抗原多糖抗原抗原种类抗原种类抗原的种类抗原的种类半抗原（只有反应原性而无免疫原性）半抗原（只有反应原性而无免疫原性）完全抗原完全抗原微生物抗原成分微生物抗原成分-细菌抗原成分细菌抗原成分菌体抗原菌体抗原:革兰氏阴性菌的菌体抗原称革兰氏阴性菌的菌体抗原称O O抗原抗原-脂脂多糖蛋白质的复合物多糖蛋白质的复合物微生物抗原微生物抗原鞭毛抗原称为鞭毛抗原称为H H抗原抗原表面抗原表面抗原:不同细菌的表抗原名称不同不同细菌的表抗原名称不同.大肠杆菌的大肠杆菌的表面抗原称为封套抗原或表面抗原称为封套抗原或K K抗原抗原,肺炎双球菌的叫荚膜肺炎双球菌的叫荚膜抗原

4、抗原,伤寒沙门氏菌的表面抗原称为伤寒沙门氏菌的表面抗原称为ViVi抗原抗原细菌抗原细菌抗原细菌的各种抗原微生物抗原微生物抗原颗粒抗原颗粒抗原组分抗原组分抗原可溶性抗原可溶性抗原微生物抗原成分微生物抗原成分-病毒抗原成分病毒抗原成分抗体是由抗原刺激人体或动物体的是由抗原刺激人体或动物体的B B细胞细胞,由由B B细胞转化成细胞转化成浆 细 胞 所 产 生 的 具 有 特 异 性 的 免 疫 球 蛋 白浆 细 胞 所 产 生 的 具 有 特 异 性 的 免 疫 球 蛋 白(immunoglobulin,(immunoglobulin,缩写为缩写为IgIg)抗体抗体(antigen)抗体种类IgIg

5、：存在于血清（占血清免疫球蛋白总量：存在于血清（占血清免疫球蛋白总量的的80%80%）和组织液中。）和组织液中。抗体的结构和种类抗体的结构和种类IgAIgA：二体：二体IgDIgD：IgEIgE：IgMIgM：五体：五体IgG结构结构IgA结构结构IgIg：存在于血清（占血清免疫球蛋白总量的：存在于血清（占血清免疫球蛋白总量的13%13%）和外分泌液中和外分泌液中IgM 等结构等结构IgIg：血液中：血液中 IgIg：血清中，：血清中，1%1%IgIg：血清中，：血清中，0.002%0.002%抗体的产生部位淋巴器官淋巴器官一级淋巴器官一级淋巴器官二级淋巴器官二级淋巴器官胸腺胸腺骨髓骨髓(鸟鸟

6、)法氏囊法氏囊淋巴结（约淋巴结（约500-600个）个）脾脏脾脏抗体在人体中产生部位抗体在人体中产生部位 thymusBone marrowspleenLymph node抗体的存在部抗体的存在部位位:血清、乳汁、血清、乳汁、体液体液抗抗体体作作用用抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）抗原抗体反应抗原抗体反应（抗原抗体反应（antigen-antibodyreactionantigen-antibodyreaction）是指抗原与相应）是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（invivoinvivo），），也可发生于体外也

7、可发生于体外(invitro(invitro)。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类中和毒素等作用；体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同，型及参与反应的介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称

8、为血的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清反应（清反应（erologicreactionerologicreaction）。）。抗原抗体反应条件抗原抗体反应条件抗原抗体抗原抗体反应条件反应条件1.1.抗原抗原2.2.抗体抗体3.3.环境因素：环境因素：（1 1）电介质：）电介质：0.85%NaCI0.85%NaCI；（2 2）温度：）温度：3737或或5656（3 3）pHpH值：值：7.07.0（4 4）振荡：）振荡：适当的机械振荡适当的机械振荡（5 5）反应时间反应时间抗原抗体反应一般规律特异性和交叉性特异性和交叉性 若两种抗原之间含有若两种抗原之间含有部分共同抗原部分共

9、同抗原时，则发生交叉反时，则发生交叉反应。应。亲缘关系越近，交叉反应的程度也越高。反应的可逆性反应的可逆性 抗原与抗体的结合为抗原与抗体的结合为分子表面的结合，分子表面的结合，结合的适宜温结合的适宜温度为度为040、pH在在4.09.0范围内。如温度超过范围内。如温度超过60或或pH降到降到3.0以下，或加入解离剂台硫氰化钾、以下，或加入解离剂台硫氰化钾、尿素等，则抗原抗体复合物又可重新解离，解离后的尿素等，则抗原抗体复合物又可重新解离，解离后的抗原或抗体性质不改变。抗原或抗体性质不改变。抗原抗体反应一般规律最适比和带现象最适比和带现象 只有抗原与抗体呈适当比例时，才可出现可见的结合只有抗原与

10、抗体呈适当比例时，才可出现可见的结合反应。反应。当抗原过多或抗体过多，则抗原抗体的结合不能形成当抗原过多或抗体过多，则抗原抗体的结合不能形成大的复合物，因而抑制可见反应的出现，这一现象称大的复合物，因而抑制可见反应的出现，这一现象称为带现象。为带现象。抗体过多出现的抑制现象称前带现象，而抗原过多出抗体过多出现的抑制现象称前带现象，而抗原过多出现的抑制现象称后带现象。现的抑制现象称后带现象。为了克服带现象，在进行血清学试验时，需将抗原或为了克服带现象，在进行血清学试验时，需将抗原或抗体作适当稀释。抗体作适当稀释。抗原抗体反应一般规律反应的二阶段性反应的二阶段性 结合阶段结合阶段-反应发生快，几秒

11、钟至几分钟反应发生快，几秒钟至几分钟 。反应阶段反应阶段-较慢，需几分钟、几十分钟或更长时较慢，需几分钟、几十分钟或更长时间间 。凝集反应颗粒性抗原（如细菌、红血球等）或颗粒性抗原（如细菌、红血球等）或吸附在乳胶、吸附在乳胶、白陶土、离子交换树脂和红细胞的抗原白陶土、离子交换树脂和红细胞的抗原与其特异性与其特异性抗体结合后，在有电介质存在时，凝聚成肉眼可见抗体结合后，在有电介质存在时，凝聚成肉眼可见的凝集小块。的凝集小块。凝集原凝集原凝集素凝集素直接凝集反应直接凝集反应玻片法玻片法试管法试管法抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-凝集反应凝集反应血清凝集试验间接凝集反应间接凝集反应将可溶性抗原（或

12、抗体）吸附于与免疫无关的小将可溶性抗原（或抗体）吸附于与免疫无关的小颗粒（载体）表面，加入相应的抗体（或抗原），颗粒（载体）表面，加入相应的抗体（或抗原），在适宜条件下，发生凝集反应。在适宜条件下，发生凝集反应。载体：动物的红血球；聚苯乙烯乳胶；矽酸铝；载体：动物的红血球；聚苯乙烯乳胶；矽酸铝；活性炭等。活性炭等。抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-间接凝集反应间接凝集反应间接血凝试验间接血凝试验间接血凝试验间接血凝试验吸附抗原的红细胞就称为致敏红细胞。致敏红细胞吸附抗原的红细胞就称为致敏红细胞。致敏红细胞与相应抗体结合后，能出现红细胞凝集现象。与相应抗体结合后，能出现红细胞凝集现象。用已知抗原

13、吸附于红细胞上检测未知抗体称为正向用已知抗原吸附于红细胞上检测未知抗体称为正向间接血凝试验，用已知抗体吸附于红细胞上鉴定未间接血凝试验，用已知抗体吸附于红细胞上鉴定未知抗原称为反向间接血凝试验。知抗原称为反向间接血凝试验。常用的红细胞有绵羊、家兔、鸡及人的常用的红细胞有绵羊、家兔、鸡及人的O O型红细胞。型红细胞。抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-间接凝集反应间接凝集反应间接血凝抑制试验间接血凝抑制试验间接血凝抑制试验间接血凝抑制试验抗体与游离抗原结合后就不能凝集抗原致敏的红抗体与游离抗原结合后就不能凝集抗原致敏的红细胞，从而使红细胞凝集现象受到抑制，这一试细胞，从而使红细胞凝集现象受到抑制，

14、这一试验被称为间接血凝抑制试验验被称为间接血凝抑制试验。抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-间接凝集反应间接凝集反应乳胶凝集试验乳胶凝集试验乳胶凝集试验乳胶凝集试验 以乳胶颗粒作为载体的间接凝集试验，称为以乳胶颗粒作为载体的间接凝集试验，称为乳胶凝集试验。该试验既可检测相应的抗体也可乳胶凝集试验。该试验既可检测相应的抗体也可鉴定未知的抗原，而且方法简便、快速，在临床鉴定未知的抗原，而且方法简便、快速，在临床诊断中广泛应用于伪狂犬病、流行性乙型脑炎、诊断中广泛应用于伪狂犬病、流行性乙型脑炎、钩端螺旋体病、猪细小病毒病、猪传染性萎缩性钩端螺旋体病、猪细小病毒病、猪传染性萎缩性鼻炎、禽衣原体病、山羊传

15、染性胸膜肺炎、囊虫鼻炎、禽衣原体病、山羊传染性胸膜肺炎、囊虫病等的诊断。病等的诊断。抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-间接凝集反应间接凝集反应协同凝集试验协同凝集试验协同凝集试验协同凝集试验 葡萄球菌葡萄球菌A蛋白是大多数金黄色葡萄球菌的蛋白是大多数金黄色葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多种哺乳动物血清中的特异性表面抗原，能与多种哺乳动物血清中的IgG分子的分子的Fc片段相结合，结合后的片段相结合，结合后的IgG仍保持其仍保持其抗体活性。当这种覆盖着特异性抗体的葡萄球菌抗体活性。当这种覆盖着特异性抗体的葡萄球菌与相应抗原结合时，可以相互连接引起协同凝集与相应抗原结合时，可以相互连接引起协同凝集反

16、应，在玻板上数分钟内即可判定结果反应，在玻板上数分钟内即可判定结果(加图图加图图八八)。目前已广泛应用于快速鉴定细菌、霉形体和。目前已广泛应用于快速鉴定细菌、霉形体和病毒等病毒等 抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-间接凝集反应间接凝集反应碳粉凝集试验碳粉凝集试验炭粉凝集试验炭粉凝集试验 以极细的活性炭粉作为载体的间接凝集试验，以极细的活性炭粉作为载体的间接凝集试验，称为炭粉凝集试验。反应在玻板上或塑料反应盘称为炭粉凝集试验。反应在玻板上或塑料反应盘进行，数分钟后即可判定结果。通常是用抗体致进行，数分钟后即可判定结果。通常是用抗体致敏炭粉颗粒制成炭素血清，用以检测抗原，如马敏炭粉颗粒制成炭素血清

17、，用以检测抗原，如马流产沙门氏菌；也可用抗原致敏炭粉，用以检测流产沙门氏菌；也可用抗原致敏炭粉，用以检测抗体，如腺病毒感染、沙门氏菌病、大肠杆菌病、抗体，如腺病毒感染、沙门氏菌病、大肠杆菌病、囊虫病等的诊断。囊虫病等的诊断。抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-间接凝集反应间接凝集反应抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-沉淀反应沉淀反应（precipitation reaction)可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等）解液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等）与相应的抗体结合，在适量电介质存在下，形成与相应

18、的抗体结合，在适量电介质存在下，形成肉眼可见的细微的白色沉淀。肉眼可见的细微的白色沉淀。抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-沉淀反应沉淀反应（precipitation reaction)可溶性可溶性抗原抗原+相应抗体相应抗体 肉眼可见的沉淀肉眼可见的沉淀沉淀反应沉淀反应环状沉淀反应环状沉淀反应絮状沉淀反应絮状沉淀反应抗原沉淀环抗血清抗原抗血清混合抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-沉淀反应沉淀反应常用于毒素、类毒素常用于毒素、类毒素和抗毒素的定量测定和抗毒素的定量测定 主要用于抗原的定性试验，如炭疽主要用于抗原的定性试验，如炭疽病的诊断（病的诊断（Ascoli氏试验）、链球氏试验）、链球菌的血清

19、型鉴定和血迹鉴定等菌的血清型鉴定和血迹鉴定等 沉淀反应沉淀反应沉淀反应沉淀反应-凝胶扩散试验凝胶扩散试验：1%琼脂凝胶的孔径约85毫微米，可允许各种抗原抗体自由扩散。由近及远形成浓度梯度。单向单扩散单向单扩散单向双扩散单向双扩散抗原抗血清+琼脂抗原琼脂抗血清+琼脂沉淀反应沉淀反应沉淀反应沉淀反应-琼脂扩散试验琼脂扩散试验：双向单扩散双向单扩散双向双扩散双向双扩散抗血清+琼脂抗原沉淀线孔径3mm 抗原待检血清标准阳性抗血清单向免疫扩散A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab；D：扩散率近似，浓度Ag Ab；E：浓度Ag A

20、b，扩散率Ag Ab；F：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系双向琼脂扩散(1)沉淀线吻合：待检抗原与沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。标准抗原完全相同。(2)沉淀线相切：待检抗原中沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相还含有另外的抗原与抗血清相对应。对应。(3)沉淀线相交：待检抗原有沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。准抗原不同。(4)沉淀线部分吻合：待测抗沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含原和标准抗原性质相同，但含量较低

21、。量较低。A1：待检抗原；A2：标准抗原双响琼脂扩散 抗体效价滴定用梅花型孔，中间放抗原，用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的最高稀释倍数为该抗体的效价。的效价。对流免疫电泳对流免疫电泳在pH为8.6的琼脂凝胶板上打孔，两孔为一组，孔径3mm，抗原、抗体孔间距为45mm。将抗原加入负极端孔内，抗体加入正极端孔内，用24mA/cm电流电泳1h左右，观察结果，在两孔之间出现沉淀带的为阳性反应。在在pH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白因等电点高，只的琼脂凝胶中，抗体球蛋白因等电点高，只带有微弱的负电荷，

22、而且分子又较大，因此电泳力小，带有微弱的负电荷，而且分子又较大，因此电泳力小，小于电渗力，泳向负极；而一般抗原蛋白质常带较强小于电渗力，泳向负极；而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子较小，电泳力大，大于电渗力，泳向的负电荷，分子较小，电泳力大，大于电渗力，泳向正极，电泳时抗原放负极侧，抗体放正极侧，抗原抗正极，电泳时抗原放负极侧，抗体放正极侧，抗原抗体相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相体相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，在比例适当处形成肉眼可见的沉淀线。遇，在比例适当处形成肉眼可见的沉淀线。对流免疫电泳原理对流免疫电泳原理对流免疫电泳结果判定 1为阳性2为弱阳性3/4

23、为强阳性对流电泳方法评价对流电泳方法评价简便、快速、敏感度较双向琼脂扩散试验高简便、快速、敏感度较双向琼脂扩散试验高810倍，但分辨力低于双向琼脂扩散试验。倍，但分辨力低于双向琼脂扩散试验。火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis,RIE)火箭免疫电泳火箭免疫电泳火箭免疫电泳是单向单扩散和电泳技术相结合的一种血清学试验。是让抗原在电场的作用下，在含有抗体的琼脂中定向泳动，二者比例合适时形成类似火箭样的沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比。火箭免疫操作步骤火箭免疫操作步骤1.制备抗体琼脂糖凝胶板制备抗体琼脂糖凝胶板 将已融化的将已融化的1.2%巴比妥缓冲琼脂糖冷巴

24、比妥缓冲琼脂糖冷却至却至55左右，加入适量抗血清，混匀后立即浇板，置室温凝固。左右，加入适量抗血清，混匀后立即浇板，置室温凝固。2.打孔打孔 在琼脂凝胶板一侧打孔，孔径在琼脂凝胶板一侧打孔，孔径3mm，孔距，孔距2mm。置琼脂。置琼脂板于电泳槽内，搭桥后用微量注射器准确加样板于电泳槽内，搭桥后用微量注射器准确加样10l。3.电泳电泳 样品孔放负极侧，电压样品孔放负极侧，电压810V/cm或电流或电流35mA/cm，电，电泳泳6h。4.观察沉淀峰观察沉淀峰 电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔中心到峰尖的高度。中心到峰尖的高度。5.绘制标准曲线图绘

25、制标准曲线图 以峰高为纵坐标，浓度为横坐标以峰高为纵坐标，浓度为横坐标(对数坐标对数坐标)，绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度火箭免疫结果火箭免疫结果若抗原与抗体比例合适，则孔前出现顶端完全闭合的若抗原与抗体比例合适，则孔前出现顶端完全闭合的火箭状沉淀峰；抗原大量过剩时或不形成沉淀峰，或火箭状沉淀峰；抗原大量过剩时或不形成沉淀峰，或沉淀峰不闭合；抗原中等过剩时沉淀峰呈圆形；当二沉淀峰不闭合；抗原中等过剩时沉淀峰呈圆形；当二者比例不适当时，常不能形成火箭状沉淀峰。者比例不适当时，常不能形成火箭状沉淀峰。火箭免疫电泳方法评价火箭免疫电泳方法评价火箭电泳是一种操

26、作简便、省时、结果重复性好的火箭电泳是一种操作简便、省时、结果重复性好的定量检测方法。其敏感度可测定量检测方法。其敏感度可测0.3mg/L抗原含量，抗原含量，若低于此水平则难以形成可见的沉淀峰。如加入少若低于此水平则难以形成可见的沉淀峰。如加入少量量125I标记的抗原在含抗体的琼脂板上电泳，形成标记的抗原在含抗体的琼脂板上电泳，形成的不可见火箭峰，经洗涤干燥后，用的不可见火箭峰，经洗涤干燥后，用X线胶片感光，线胶片感光，经显影和定影，可呈现同位素显影，这就是放射自经显影和定影，可呈现同位素显影，这就是放射自显影技术，可用于微量抗原含量测定，如测定血清显影技术，可用于微量抗原含量测定，如测定血清

27、AFP或或IgE含量，可测至含量，可测至g/L水平。水平。免疫电泳免疫电泳(immunoelectrophoresis,IEP)是将区带电泳和双向琼脂扩散相结合的一种免疫化是将区带电泳和双向琼脂扩散相结合的一种免疫化学分析技术。学分析技术。免疫电泳示意图免疫电泳操作步骤免疫电泳操作步骤1.取洁净载玻片，浇注融化的琼脂凝胶，凝固后打孔挖槽。取洁净载玻片，浇注融化的琼脂凝胶，凝固后打孔挖槽。2.用微量加样器加待检标本或正常血清对照于孔内。用微量加样器加待检标本或正常血清对照于孔内。3.电泳条件以电压电泳条件以电压46V/cm或电流或电流23mA/cm为宜，电泳为宜，电泳1.52h。4.电泳完毕后，

28、用毛细滴管在槽内加入含相应抗原，孵育，电泳完毕后，用毛细滴管在槽内加入含相应抗原，孵育，使抗原抗体双相扩散，形成沉淀线。使抗原抗体双相扩散，形成沉淀线。5.观察沉淀线的数目、形状和位置。经漂洗、干燥、染色、观察沉淀线的数目、形状和位置。经漂洗、干燥、染色、脱色等步骤制作染色标本，可长期保存。例如血浆蛋白免脱色等步骤制作染色标本，可长期保存。例如血浆蛋白免疫电泳。疫电泳。免疫电泳方法评价免疫电泳方法评价免疫电泳分辨率高，可分出人血清中免疫电泳分辨率高，可分出人血清中2030种抗原种抗原成分，可鉴定混合抗原中各组分。成分，可鉴定混合抗原中各组分。补体结合反应补体特点：补体特点：补体可与任何抗原抗体

29、复合物结合，但不能单独与补体可与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独与抗原或抗体结合。在有特异抗体存在时可以溶解细抗原或抗体结合。在有特异抗体存在时可以溶解细胞（溶菌或溶血）。胞（溶菌或溶血）。抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-补体结合反应补体结合反应有补体参加的抗原抗体反应。有补体参加的抗原抗体反应。补体结合反应补体结合反应抗原抗原 +抗体抗体抗原抗体复合物抗原抗体复合物补体补体羊红细胞羊红细胞 +溶血素溶血素羊红细胞溶血素复合物羊红细胞溶血素复合物（不溶血）（不溶血）抗原抗原 +抗体抗体不结合不结合羊红细胞羊红细胞 +溶血素溶血素羊红细胞溶血素复合物羊红细胞溶血素复合物 （溶血）（溶血）补体

30、补体指示系统：反应系统：补体结合反应标记抗原抗体反应可用放射性同位素、荧光素或酶等标记抗可用放射性同位素、荧光素或酶等标记抗原或抗体。原或抗体。抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-标记抗原抗体反应标记抗原抗体反应免疫荧光技术免疫荧光技术是用荧光色素对抗体或抗原进行标记，再与相应是用荧光色素对抗体或抗原进行标记，再与相应抗原或抗体结合，然后在荧光显微镜下观察荧光以抗原或抗体结合，然后在荧光显微镜下观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。分析示踪相应的抗原或抗体的方法。常用的荧光色素有异硫氰酸荧光素（常用的荧光色素有异硫氰酸荧光素（FITC），），此外还有四乙基罗丹明（此外还有四乙基罗丹明（RB2

31、00）、四甲基异硫氰）、四甲基异硫氰酸罗丹明（酸罗丹明（TMRITC）和三氯三嗪基氨基荧光素）和三氯三嗪基氨基荧光素（DTAF）等）等。免免疫疫荧荧光光法法荧光标记法荧光标记法抗原抗体抗原抗抗体抗体直接免疫荧光法直接免疫荧光法间接免疫荧光法间接免疫荧光法酶标记抗体技术（免疫酶技术）酶标记抗体技术（免疫酶技术）是利用抗原抗体的特异性结合和酶的高效特异的催是利用抗原抗体的特异性结合和酶的高效特异的催化作用显色而建立起来的免疫检测技术。化作用显色而建立起来的免疫检测技术。常用的标记酶是辣根过氧化物酶（常用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRP），其作用），其作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，常用的供氢

32、体底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，常用的供氢体有有3，3-二氨基联苯胺（二氨基联苯胺（DAB）和邻苯二胺（）和邻苯二胺（OPD），），前者反应后形成不溶性的棕色物质，适用于免疫酶组前者反应后形成不溶性的棕色物质，适用于免疫酶组化法；后者反应后形成可溶性的橙色产物，敏感性高，化法；后者反应后形成可溶性的橙色产物，敏感性高，易被酸终止反应，呈现的颜色可数小时不变，是易被酸终止反应，呈现的颜色可数小时不变，是ELISA中常用的供氢体。中常用的供氢体。酶标记抗体技术（免疫酶技术）酶标记抗体技术（免疫酶技术）直接法直接法 用用酶标记抗体酶标记抗体直接处理含待检抗原的标本，洗涤后浸于含直接处理含待检抗原

33、的标本，洗涤后浸于含有过氧化氢和有过氧化氢和DAB的显色反应液中作用，然后在普通光学显的显色反应液中作用，然后在普通光学显微镜下观察颜色反应，抗原所在部位呈棕黄色。微镜下观察颜色反应，抗原所在部位呈棕黄色。间接法间接法 含待检抗原的标本先用未标记的抗血清处理，洗涤后再用含待检抗原的标本先用未标记的抗血清处理，洗涤后再用相应的相应的酶标记抗抗体酶标记抗抗体处理，洗涤，然后浸于含有过氧化氢和处理，洗涤，然后浸于含有过氧化氢和DAB的显色反应液中作用，普通光学显微镜下观察颜色反应，的显色反应液中作用，普通光学显微镜下观察颜色反应，以指示是否有抗原以指示是否有抗原-抗体抗体-抗抗体复合物存在抗抗体复合

34、物存在。酶联免疫吸附试验（简称酶联免疫吸附试验（简称ELISA）将抗原或抗体吸附于将抗原或抗体吸附于固相载体固相载体的表面，酶标记的表面，酶标记物与相应的抗体或抗原反应后，形成酶标记抗原物与相应的抗体或抗原反应后，形成酶标记抗原抗体复合物，在遇到相应底物时，结合物上的酶抗体复合物，在遇到相应底物时，结合物上的酶催化底物产生水解、氧化或还原等反应，从而生催化底物产生水解、氧化或还原等反应，从而生成可溶性或不溶性的有色物质，可用肉眼或酶标成可溶性或不溶性的有色物质，可用肉眼或酶标测定仪判定结果。颜色的深浅与相应的抗体或抗测定仪判定结果。颜色的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，因此，可根据颜色的深浅来

35、定量抗原量成正比，因此，可根据颜色的深浅来定量抗体或抗原。体或抗原。直接法直接法将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附的将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附的抗原，加入一定量的抗原，加入一定量的酶标记抗体酶标记抗体与样品与样品(含有抗含有抗原原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原表面形成抗原-抗体抗体-酶复合物。洗除多余部分，酶复合物。洗除多余部分，加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解应，产生有色物质。通过酶标检测仪，测出酶解应，产生有色物质。通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推

36、知被测样品中的抗原量。底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。间接法间接法将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品加入一定量抗体与待测样品(含有抗原含有抗原)提取液的混提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗酶标记的抗抗体抗体，与吸附在固体表面的抗原，与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合，抗体复合物相结合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下底物发生降解再加入酶的底物。在酶的催化作

37、用下底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪测出酶底物反应，产生有色产物，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。斑点酶联免疫吸附试验斑点酶联免疫吸附试验 以纤维素薄膜为固相载体，在膜上进行免疫酶反以纤维素薄膜为固相载体，在膜上进行免疫酶反应。先将抗原或抗体吸附在纤维素膜的表面，通应。先将抗原或抗体吸附在纤维素膜的表面，通过相应的抗体或抗原和酶标记物的一系列反应，过相应的抗体或抗原和酶标记物的一系列反应，形成酶标记抗原抗体复合物，加入底物后，结合形成酶标记抗原抗体复合物，加入底物后，结合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一种带色

38、物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一种带色物质，沉着于抗原抗体复合物吸附部位，呈现出物质，沉着于抗原抗体复合物吸附部位，呈现出肉眼可见的颜色斑点，试验结果可通过颜色斑点肉眼可见的颜色斑点，试验结果可通过颜色斑点的出现与否和色泽深浅进行判定。的出现与否和色泽深浅进行判定。免疫转印技术免疫转印技术(immuno-blot)1979年年Towbin将核酸转印技术（将核酸转印技术（Southern blot）应用于）应用于蛋白质研究，建立了蛋白质转印技术（蛋白质研究，建立了蛋白质转印技术（Western blot）。）。免疫转印技术的基本原理是将凝胶电泳与固相免疫测定结合免疫转印技术的基本原理是将凝胶

39、电泳与固相免疫测定结合起来，将经电泳分区的蛋白质精确且近似定量地转移到固相起来，将经电泳分区的蛋白质精确且近似定量地转移到固相载体上如硝酸纤维素膜载体上如硝酸纤维素膜(NC膜膜)，并保持其原有的生物活性，并保持其原有的生物活性，再经荧光免疫、酶免疫、放射免疫技术等进行测定，可得以再经荧光免疫、酶免疫、放射免疫技术等进行测定，可得以定位、定性和定量结果。实质上分定位、定性和定量结果。实质上分3步骤即蛋白质组分分离、步骤即蛋白质组分分离、各组分转印及免疫检测。各组分转印及免疫检测。免疫转印技术操作步骤免疫转印技术操作步骤1.蛋白质分离蛋白质分离 采用聚丙稀酰胺凝胶电泳采用聚丙稀酰胺凝胶电泳(pol

40、yacryamide gel electrophoresis,PAGE)进行分进行分离。离。2.蛋白质转印蛋白质转印 从凝胶上将蛋白质转移至从凝胶上将蛋白质转移至NC膜膜 等固相载体的过程即为蛋白质转印。等固相载体的过程即为蛋白质转印。3.蛋白质的免疫检测蛋白质的免疫检测 将已转印将已转印NC膜封闭，用酶免疫膜封闭，用酶免疫组化技术、免疫金组化技术等检测。组化技术、免疫金组化技术等检测。免疫转印技术方法评价免疫转印技术方法评价免疫转印技术综合了免疫转印技术综合了PAGE的高分辨力和免疫标记技的高分辨力和免疫标记技术的高度特异性和敏感性。术的高度特异性和敏感性。PAGE具有电荷效应、分具有电荷效

41、应、分子筛效应和浓缩效应，使之具有高度的分辨力，在同子筛效应和浓缩效应，使之具有高度的分辨力，在同一固相载体上可作多项成分的分析。一固相载体上可作多项成分的分析。中和试验中和试验病毒或毒素与相应抗体结合后，丧失了对易感动病毒或毒素与相应抗体结合后，丧失了对易感动物、鸡胚和易感细胞的致病力，称为中和试验。物、鸡胚和易感细胞的致病力，称为中和试验。中和试验中和试验中和试验中和试验免疫磁珠富集方法检测免疫磁珠富集方法检测肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O157：H7 检样检样25g25g 传统的增菌培养传统的增菌培养 取一定量的增菌液取一定量的增菌液+Dynabeads+Dynabeads anti-O 157 anti-O 157磁珠反应一定时间磁珠反应一定时间 在磁场中倒掉液体在磁场中倒掉液体 用缓冲液清洗几次用缓冲液清洗几次 收集磁珠收集磁珠+E.Coli+E.Coli O157 O157复合体复合体 在选择性培养基上进行培养在选择性培养基上进行培养 优点：准确率高、优点：准确率高、可靠、灵敏度高，特异性强。可靠、灵敏度高，特异性强。Thanks