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1、维生素维生素B B2 2的分子荧光测定的分子荧光测定一、目的要求一、目的要求、了解分子荧光分析法的原理。、了解分子荧光分析法的原理。、掌握用荧光法测定维生素的分析方法。、掌握用荧光法测定维生素的分析方法。、掌握荧光光度计的基本操作方法。、掌握荧光光度计的基本操作方法。二、方法原理二、方法原理 维生素维生素B B2 2又称核黄素又称核黄素,溶于水溶于水,在在WW为为0.050.05的乙酸溶的乙酸溶液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中，对热稳液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中，对热稳定，在碱性溶液中较易被破坏。通过实验确定它的最佳定，在碱性溶液中较易被破坏。通过实验确定它的最佳激发波长（
2、激发波长（370nm370nm和和440nm440nm）和发射波长（）和发射波长（560nm560nm），），在所确定的波长条件下，测定维生素在所确定的波长条件下，测定维生素B2B2标准系列溶液标准系列溶液的荧光强度和浓度的工作曲线。用标准曲线法测定生物的荧光强度和浓度的工作曲线。用标准曲线法测定生物样品（蔬菜）中的维生素样品（蔬菜）中的维生素B B2 2含量。含量。三、实验步骤三、实验步骤1 1标准系列溶液的配制标准系列溶液的配制 用吸管移取维生素用吸管移取维生素B B2 2标准贮备溶液标准贮备溶液10.00mL10.00mL于于100mL100mL容量瓶中，用容量瓶中，用WW为为0.050
3、.05的乙酸稀释至的乙酸稀释至刻度，摇匀。吸取该稀释溶液刻度，摇匀。吸取该稀释溶液(10.0mgL(10.0mgL-1-1)0,0.50,1.00,2.00,3.00 0,0.50,1.00,2.00,3.00和和4.00mL4.00mL，分别放入六，分别放入六只只100mL100mL容量瓶中，用容量瓶中，用WW为为0.050.05的乙酸稀释至的乙酸稀释至刻度，摇匀，此标准系列溶液的浓度分别为刻度，摇匀，此标准系列溶液的浓度分别为0,0.050,0.10,0.20,0.300,0.050,0.10,0.20,0.30和和0.40 mgL0.40 mgL-1-1。2.2.样品溶液制备样品溶液制备
4、 称取称取50g50g新鲜蔬菜，加新鲜蔬菜，加40mL40mL水压汁，将菜水压汁，将菜汁加入汁加入20mL1mol.L20mL1mol.L-1-1HClHCl和和10mL10mL水煮沸水煮沸1h1h，冷却，不断搅拌滴加冷却，不断搅拌滴加2mol.L2mol.L-1-1NaOHNaOH，调节，调节pHpH为为6 6，再用稀，再用稀HClHCl调节调节pHpH至至4.54.5，过滤，用，过滤，用水洗涤样品，洗涤液和过滤液合并定量转移水洗涤样品，洗涤液和过滤液合并定量转移至至100mL100mL容量瓶中，加水稀释至刻度容量瓶中，加水稀释至刻度。3.3.工作曲线绘制工作曲线绘制 取标准系列溶液之一，试
5、验实验条件，找取标准系列溶液之一，试验实验条件，找出最佳荧光发射波长。在所确定的波长条件出最佳荧光发射波长。在所确定的波长条件下测定标准系列溶液的荧光强度，绘制荧光下测定标准系列溶液的荧光强度，绘制荧光强度与浓度的工作曲线。强度与浓度的工作曲线。4.4.测定测定 分别吸取分别吸取10.00mL10.00mL样品溶液三份，依次置样品溶液三份，依次置于三只于三只25.00mL25.00mL容量瓶中，加入容量瓶中，加入1.25mL1.25mL冰醋冰醋酸，再加入酸，再加入KMnOKMnO4 4溶液溶液(3%)0.5mL(3%)0.5mL，放置，放置2min2min，边摇边滴，边摇边滴H H2 2OO2
6、 2(30%)(30%)，使，使KMnOKMnO4 4刚刚好褪色，用纯水稀释至刻度，在荧光光度计好褪色，用纯水稀释至刻度，在荧光光度计上分别测定其荧光强上分别测定其荧光强 四、结果处理四、结果处理 1.1.在坐标纸上绘制在坐标纸上绘制I If fCC的工作曲线的工作曲线 2.2.根据测定的根据测定的I If.xf.x，从工作曲线上查出溶液中维，从工作曲线上查出溶液中维生素生素V VB B2 2的的C Cx x（mg/Lmg/L）3.3.由下式计算出样品（新鲜蔬菜）中的维生素由下式计算出样品（新鲜蔬菜）中的维生素V VB B2 2的含量（的含量（mg/100gmg/100g）V VB B2 2
7、（mg/100gmg/100g）=C=Cx x 25.0025.001010-3-3 （100/10100/10）（1/W1/WS S）100100 五、实验注意事项五、实验注意事项1 1、配制标准系列溶液采用、配制标准系列溶液采用5%HAc5%HAc溶液定容，配制样溶液定容，配制样品溶液采用蒸馏水定容。品溶液采用蒸馏水定容。2 2、用、用5mL5mL移液管量取移液管量取2 2、3 3、4mL4mL溶液时必须先吸到溶液时必须先吸到满刻度；满刻度；3 3、用浓度最大的标准溶液找出最佳荧光发射波长，、用浓度最大的标准溶液找出最佳荧光发射波长，并确定测定时仪器工作条件（选择合适的灵敏度值并确定测定时仪器工作条件（选择合适的灵敏度值与纵坐标放大值）；与纵坐标放大值）；4 4、过滤时先将样品液分批倒入小布袋，用漏斗接液，、过滤时先将样品液分批倒入小布袋，用漏斗接液，漏斗下端直接用漏斗下端直接用100mL100mL容量瓶接液；容量瓶接液；5 5、提取液中加、提取液中加10%10%双氧水应逐滴加入使高锰酸钾刚双氧水应逐滴加入使高锰酸钾刚好颜色褪去（边滴边摇）；好颜色褪去（边滴边摇）；6 6、样品液测定条件与标准曲线测定条件一致（测定、样品液测定条件与标准曲线测定条件一致（测定时所用灵敏度值与纵坐标放大值一致）；时所用灵敏度值与纵坐标放大值一致）；
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