酵母双杂交系统ppt课件

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1、用酵母双杂交系统用酵母双杂交系统研究蛋白质研究蛋白质-蛋白质蛋白质相互作用相互作用蛋白质之间相互作用研究的重要蛋白质之间相互作用研究的重要性性 蛋白质之间相互作用以及通过相互作用蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括几乎所有的重要生命活动，包括DNA的的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。作用。研究蛋白质相互作用的常用方法研究蛋白质相互作用的常用方法酵

2、母双杂交（酵母双杂交（yeast two hybridization）亲和层析亲和层析免疫共沉淀免疫共沉淀蛋白质交联蛋白质交联基于基于GFPGFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方的细胞内蛋白质相互作用的研究方法法噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母酵母中进行的，研究中进行的，研究活细胞内活细胞内蛋白质相互作用，蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因报告基因的表达产物敏感地检测得到。的表达产物敏感地检测得到。第一节第一节 酵母双杂交系统简介酵母双杂交系统简介 它是一种具有

3、很高灵敏度的研究蛋白质之它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。间关系的技术。该技术既可用来研究该技术既可用来研究哺乳动物哺乳动物基因组编码基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等高等植物植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。基因组编码的蛋白质之间的相互作用。一、酵母双杂交系统的建立和基本原理一、酵母双杂交系统的建立和基本原理经典文献出处经典文献出处vFields S,Song O.A novel genetic system to detect protein-protein interactions.Nature,1989,340(6

4、230):245-246（一）酵母双杂交系统的建立（一）酵母双杂交系统的建立 1989年美国纽约州立大学的年美国纽约州立大学的Fields和和Song首先描述首先描述了酵母双杂交系统了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：转录激活因子转录激活因子DNA结合结构域结合结构域(BD)(DNA binding

5、 domain)转录激活结构域转录激活结构域(AD)(activation domain)这两个结构域各具功能，互不影响这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。特定基因表达的激活因子的功能。Gal4为酵母半乳糖苷酶基因为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活的转录激活因子，天然的因子，天然的Gal4分子是由一条由分子是由一条由881个氨基个氨基酸残基组成的多肽链。酸残基组成

6、的多肽链。两个结构域中的两个结构域中的DNA-BD由位于由位于N-末端的末端的1147位多肽构成，能识别位于位多肽构成，能识别位于Gal4基因的上基因的上游激活序列游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。此外，在其此外，在其N-端还具有一段核定位序列。端还具有一段核定位序列。AD由位于由位于C-末端的末端的768881位多肽构成。位多肽构成。当当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转作为转录因子的活性。录因子的活性。Fields和和Song将两个融

7、合蛋白分别构建在穿梭将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将质粒上，一个是将Gal4的的DNA-BD与酵母蛋白与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将融合；另一个是将Gal4的的AD和酵母蛋白和酵母蛋白SNF4融合。融合。其中，其中，SNF1是一种丝氨酸是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激苏氨酸的蛋白激酶，酶，SNF4是它的一个结合蛋白，是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是这两种蛋白是已知可以相互作用的已知可以相互作用的。当两种穿梭质粒共转化含有当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报结合位点的报告基因告基因LacZ的酵母菌株后，通过的酵母菌株后，通过SNFl与与SNF4的的相互作用，相互作用，Gal4

8、的的DNA-BD与与Gal4的的AD靠近靠近,形形成一个大的复合物成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的的DNA-BD可识别位于可识别位于Gal4效应基因的效应基因的UAS，并可与之结合；，并可与之结合；Gal4的的AD则可与转录复合物中其他成分结合，则可与转录复合物中其他成分结合，激活激活UAS下游报告基因下游报告基因LacZ的转录。的转录。酵母转录因子（酵母转录因子（Gal 4）与与BD-fusion -诱饵（诱饵（bait）与与AD-fusion -猎物或靶蛋白（猎物或靶蛋白（prey or target protein）报告基因（报告基因（repo

9、rter gene）-Lac Z（编码（编码-半乳糖苷酶）半乳糖苷酶）（二）酵母双杂交系统的原理（二）酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter geneXDNA-BD 酵母细胞酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点许多优点:v 易于转化、便于回收扩增质粒易于转化、便于回收扩增质粒v 具有可直接

10、进行选择的具有可直接进行选择的和特征性和特征性v 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相 互结合互结合报道株报道株 经经的、含报告基因的重组质粒的宿的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。主细胞。v 基因组中基因组中是缺失型的是缺失型的v 基因组中引入额外的报告基因基因组中引入额外的报告基因、改造后的酵母细胞的特点：改造后的酵母细胞的特点：通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落 表达表达“诱饵诱饵”和和“猎物猎物”蛋白；蛋白；检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。告基因

11、。做法：首先构建能表达做法：首先构建能表达“诱饵诱饵”和和“猎物猎物”蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。筛选的基因。二、酵母双杂交系统的基本策略二、酵母双杂交系统的基本策略三、酵母双杂交系统的优点三、酵母双杂交系统的优点1.高敏感性。高敏感性。原因：原因：采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；蛋白过量表达；激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合

12、更趋于稳定；合蛋白各组分间结合更趋于稳定；通过通过mRNA使信号放大；使信号放大；检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。三、酵母双杂交系统的优点三、酵母双杂交系统的优点1.高敏感性。高敏感性。2.真实性。真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。3.简洁性。简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁

13、琐步骤。纯化蛋白质的繁琐步骤。4.广泛性。广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。蛋白。分析已知蛋白之间的相互作用分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。突变或缺失突变再进行双杂交。用已知功能蛋白质筛选双杂交用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋文库，研究蛋白质之间相互

14、作用的传递途径，发现新基因。白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。绘制蛋白质相互作用系统图谱绘制蛋白质相互作用系统图谱 在药物设计中的应用在药物设计中的应用四、酵母双杂交系统的应用现状四、酵母双杂交系统的应用现状利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质 的新功能的新功能 将已知基因作为将已知基因作为诱饵诱饵，在选定的，在选定的cDNA文库中文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到

15、的阳性筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到酵母菌株中可以分离得到AD-文库载体，并从载体文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片片段，并对该片段的编码序列在段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。已知基因在生物学功能上的联系。利用酶联免疫（利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可研究抗原技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可研究抗原和抗体之间的相互作用，但它们都是基于和抗体之间的相互作用，但它

16、们都是基于体外非细胞体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞细胞体内体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。进行检测。利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和 抗体的相互作用抗体的相互作用利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及 药物对蛋白质之间相互作用的影响药物对蛋白质之间相互作用的影响 对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作可采取药物干扰的方法，阻止

17、它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。用以达到治疗疾病的目的。利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 （Genome Protein Linkage Map）基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和的基因和EST序列。序列。利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基

18、因组蛋白连锁白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。谢途径等有重要意义。五、酵母双杂交系统中常见问题的解决和五、酵母双杂交系统中常见问题的解决和改进措施改进措施（一）（一）假阳性较多假阳性较多（二）（二）转化效率偏低转化效率偏低（三）（三）阴性干扰阴性干扰v假阳性定义假阳性定义 在待研究的两个蛋白间没有发生相在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活互作用的情况下，报告基因仍被激活。（一）（一）假阳性较多假阳性较多 BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋

19、白融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。的激活作用被外来蛋白激活。如如AD融合靶蛋白有融合靶蛋白有DNA的特异性结合，则可单的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。独激活报告基因的表达。AD融合蛋白直接与转录因子相互作用激活报告基融合蛋白直接与转录因子相互作用激活报告基因；因；AD融合靶蛋白与融合靶蛋白与BD相互作用或者相互作用或者AD与与BD融合融合蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。原因原因：排除假阳性的措施排除假阳性的措施 作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别

20、作单独激活报告基因的鉴定。独激活报告基因的鉴定。采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。目前试剂公司已采用。区各不相同。目前试剂公司已采用。报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。定。优化优化3-AT(3-aminotriazole)浓度。适当增加浓度浓度。适当增加浓度可减少假阳性。可减少假阳性。进一步分析：进一步分析：这种相互作用是否会在细胞内自然发生。这种相互作用是否会在细胞内自然发生。有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们具有普遍的蛋白间

21、的相互作用。们具有普遍的蛋白间的相互作用。一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白也可发生相互作用。白也可发生相互作用。接合型酵母细胞接合型酵母细胞cDNA文库文库 诱铒蛋白基因诱铒蛋白基因多克隆位点多克隆位点DNA-BD 载体载体 AD 载体载体转化转化转化转化a接合型酵母细胞接合型酵母细胞筛选平板筛选平板生长菌苔生长菌苔筛选平板筛选平板生长菌苔生长菌苔同一个三重筛选平板同一个三重筛选平板克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）鉴定鉴定-半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分已部分已商品化商品化两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表两个

22、蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。达程度甚低以至于检测不出来。原因：原因：酵母双杂交系统是分析蛋白酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互蛋白间相互作用的有效和快速的方法，作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，有多方面的应用，但仍存在一些但仍存在一些局限性局限性。六、酵母双杂交系统使用注意事项六、酵母双杂交系统使用注意事项酵母双杂交系统酵母双杂交系统局限性局限性1.某些诱饵蛋白具有某些诱饵蛋白具有自身激活自身激活性质。性质。-双杂交前删除该部分，但应避免删除相双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域互作用的结构域2.某些蛋白在酵母中某些蛋白在酵母中不稳

23、定表达或不能准确不稳定表达或不能准确定位定位到胞核内。在细胞表面发生的相互作到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用用可采用噬菌体显示系统噬菌体显示系统。双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。这些反应在核内无法进行。酵母双杂交系统酵母双杂交系统局限性局限性3.有时有时DNA-BD或或AD融合部分不包括相互作用位点，融合部分不包括相互作用位点，或破坏了融合蛋白的正确折叠。或破坏了融合蛋白的正确折叠

24、。4.哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究 阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究。位特异性的抗体进行共定位研究。双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。的实验手段来验证。在酵母双杂交的基础上，又发展：在酵母双杂交的基础上，又发展：酵母单杂交酵

25、母单杂交-用于核酸和文库蛋白之间的研究用于核酸和文库蛋白之间的研究酵母三杂交酵母三杂交-三种不同蛋白之间的互作研究三种不同蛋白之间的互作研究酵母的反向杂交酵母的反向杂交-两种蛋白相互作用的结构和两种蛋白相互作用的结构和位点。位点。七、反向双杂交系统和三杂交技术七、反向双杂交系统和三杂交技术 1993年，由年，由Wang和和Reed等相继创立发展等相继创立发展出一种研究蛋白质和出一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系。相互作用的实验体系。Wang MM,Reed RR.Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription facto

26、r Olf-1 by genetic selection in yeast.Nature，1993，364(6433):121-126.文献出处文献出处 在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代序列取代DNA Gal4结合位点。结合位点。该该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。质结合位点。靶靶DNA序列特异的结合蛋白序列特异的结合蛋白(BDPX)与与Gal4 P的激活结构域可融合形成融合体，的激活结构域可融合形成融合体，

27、BDPX与其与其特异特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。为表型选择性标志的报告基因的表达。理论上，酵母单杂交系统可利用靶理论上，酵母单杂交系统可利用靶DNA序列，序列，捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。该系统不仅适用于识别转录因子，也适用于该系统不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与转录抑制和研究参与转录抑制和DNA复制过程的蛋白质。复制过程的蛋白质。待筛选的蛋白待筛选的蛋白Y或或BD结构域同结构域同AD结构域融结构域融合，蛋白合，蛋白Y上游序列或上游序列或BD与待目的与

28、待目的DNA序列序列结合，导致结合，导致AD激活了报告基因表达。激活了报告基因表达。确定已知确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。蛋白质之间是否存在相互作用。分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因。结合位点蛋白的新基因。定位已经证实的具有相互作用的定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白结合蛋白的的DNA结合结构域以及准确定位与结合结构域以及准确定位与DNA结合的核结合的核苷酸序列。苷酸序列。-研究研究DNA-蛋白质相互作用蛋白质相互作用1996年，年，Vidal等人建立了反向酵母双杂交系统等人建立了反向酵母双杂交系统Vi

29、dal M,Brachmann RK,Fattaey A,Harlow E,Boeke JD.Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(19):10315-10320.该系统是一项鉴定该系统是一项鉴定阻断阻断蛋白间相互作用的技术，蛋白间相互作用的技术，核心在于构建一种反向筛选的报告基因。核心在于构建一种反向筛选的报告基因。在这系统中，野生型在这系统中，

30、野生型BD-X/AD-Y间的相互作用激间的相互作用激活一种活一种毒性标志毒性标志作为报告基因，对酵母宿主是毒性作为报告基因，对酵母宿主是毒性或致死性的，即所谓的或致死性的，即所谓的阴性阴性筛选。筛选。在此情况下在此情况下BD-X/AD-Y作用的解离作用的解离赋予酵母一种赋予酵母一种选择生长优势。选择生长优势。利用这种方法能方便地鉴定利用这种方法能方便地鉴定作用缺陷等位基因作用缺陷等位基因、解离肽或相关的小分子物质解离肽或相关的小分子物质。反向双杂交系统基本原理示意图反向双杂交系统基本原理示意图 反向双杂交系统基本原理示意图反向双杂交系统基本原理示意图 双杂交产生的相互作用激活双杂交产生的相互作

31、用激活Tet阻遏蛋白，从而抑阻遏蛋白，从而抑制阳性筛选标志制阳性筛选标志His3的表达，此时野生型相互作用使宿的表达，此时野生型相互作用使宿主细胞表现为组氨酸营养缺陷型主细胞表现为组氨酸营养缺陷型。用于筛选缺陷等位基因的研究用于筛选缺陷等位基因的研究 在稳定、全长在稳定、全长及能够形成正确蛋白质折叠的条件下，已有了几及能够形成正确蛋白质折叠的条件下，已有了几种遗传学策略来筛选作用缺陷性等位基因。种遗传学策略来筛选作用缺陷性等位基因。在反式作用解离分子方面的应用在反式作用解离分子方面的应用 在蛋白质组研究方面的应用在蛋白质组研究方面的应用 利用反向双杂交利用反向双杂交系统对文库进行预清除，则可能

32、大大减轻以后的系统对文库进行预清除，则可能大大减轻以后的假阳性鉴定工作。反向双杂交系统作为正向双杂假阳性鉴定工作。反向双杂交系统作为正向双杂交系统的补充，提出了创建整个有机体蛋白质连交系统的补充，提出了创建整个有机体蛋白质连锁图谱的设想。锁图谱的设想。第一部分第一部分 用酵母双杂交系统从人睾丸用酵母双杂交系统从人睾丸cDNA文库初步筛选与文库初步筛选与 CK2相互作用相互作用蛋白的候选克隆蛋白的候选克隆 1.1 材料材料 pGBKT7-HCK2 梁景耀构建梁景耀构建 Human Testis MATCHMARKER cDNA Library Clontech公司公司 1.2 方法方法1.2.1

33、 人睾丸组织人睾丸组织cDNA文库质粒的扩增与抽提文库质粒的扩增与抽提 (1)cDNA文库的滴度测定文库的滴度测定 (2)文库扩增：根据滴度和独立克隆数计算所需文库文库扩增：根据滴度和独立克隆数计算所需文库 原始菌液体积及铺皿个数（共涂布原始菌液体积及铺皿个数（共涂布110块块LB/Amp 培养基培养基)(3)收集培养基上生长的菌落，制备文库质粒收集培养基上生长的菌落，制备文库质粒 1 材料与方法材料与方法 毒性报告基因毒性报告基因包括包括URA3和和CYH2等。等。酵母酵母URA3基因产物一方面为合成尿嘧啶所必需，同基因产物一方面为合成尿嘧啶所必需，同时又能催化时又能催化5-FOA（5-氟乳

34、清酸）转变为毒性物质。氟乳清酸）转变为毒性物质。URA3既可作为阴性筛选标志既可作为阴性筛选标志(在含有在含有5-FOA的培养基的培养基中中)、又可作为阳性筛选标志、又可作为阳性筛选标志(在不含在不含5-FOA的培养基中的培养基中)，因此应用得更广泛。因此应用得更广泛。-半乳糖苷酶滤膜影印法初步筛选出阳性候选克隆的转化株半乳糖苷酶滤膜影印法初步筛选出阳性候选克隆的转化株2 结果结果2.1 文库的扩增与抽提文库的扩增与抽提 文库滴度为文库滴度为3.4109 cfu/ml；文库转化效率为文库转化效率为2.3105 cfu/g；共得转化子约共得转化子约1.15107 2.2-半乳糖苷酶滤膜影印分析法

35、鉴定的真阳半乳糖苷酶滤膜影印分析法鉴定的真阳 性克隆结果性克隆结果 138个克隆呈现蓝色，为阳性候选克隆个克隆呈现蓝色，为阳性候选克隆 3 讨论讨论酵母株酵母株AH109的表型的表型(Ade-，His-，Leu-，Trp-）及用以筛选的原理及用以筛选的原理酵母筛选的严谨性酵母筛选的严谨性v高严谨性高严谨性v低严谨性低严谨性v最低严谨性最低严谨性 第二部分第二部分 相互作用蛋白的进一步确证、相互作用蛋白的进一步确证、cDNA序列测定及其同源性分析序列测定及其同源性分析 pGADT7-RecAD 载体载体 共转化感受态共转化感受态酵母菌酵母菌AH109总总RNAHL-60细胞细胞HL-60细胞细胞

36、cDNA文库文库 人人CK2亚基亚基cDNA重组质粒重组质粒PCR扩增扩增 Nde I/Pst I 人人CK2cDNApGBKT7诱铒蛋白基因诱铒蛋白基因多克隆位点多克隆位点DNA-BD 载体载体 测序验证测序验证 验 证 蛋验 证 蛋白 表 达白 表 达排 除 自排 除 自主激活主激活接种在接种在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade的的缺陷培养基中缺陷培养基中,生长生长5-7天天(可以生长且可以生长且-半乳糖苷酶阳性为真阳性克隆半乳糖苷酶阳性为真阳性克隆)扩增纯化阳性克隆中质粒扩增纯化阳性克隆中质粒DNA 以以T7-Promoter为测序引物为测序引物 测定文库中与测定文库中与CK2

37、亚基相互作用蛋白的亚基相互作用蛋白的cDNA序列序列 用用GenBank 软件包作序列同源性分析，确定相互作用蛋白名称软件包作序列同源性分析，确定相互作用蛋白名称 提取酵母质粒转化感受态提取酵母质粒转化感受态JM109以实现文库质粒的分离并以实现文库质粒的分离并与与BD质粒共转化质粒共转化AH109以实现一对一回复性杂交以实现一对一回复性杂交Fig 14 HL-60 cDNA library construction and the two-hybrid screening procedure 图14 HL-60 cDNA 文库的构建和酵母双杂交的筛选过程HL-60 cDNA 文库的构建和酵母

38、双杂交的筛选过程文库的构建和酵母双杂交的筛选过程阳性候选克隆在阳性候选克隆在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上重新划线培养培养基上重新划线培养各挑取各挑取10个个-半乳糖苷酶阳性克隆半乳糖苷酶阳性克隆,提取质粒提取质粒 PCR扩增文库质粒扩增文库质粒cDNA插入片段插入片段限制性酶切分析限制性酶切分析1 方方 法法1.1 阳性候选克隆的鉴定与分组阳性候选克隆的鉴定与分组 (将第一部分实验中获得的将第一部分实验中获得的124号阳性候选号阳性候选 克隆用于进一步分析）克隆用于进一步分析）1.2 将从代表性酵母克隆中抽提的质粒转化大肠杆菌将从代表性酵母克隆中抽提的质粒转化大肠杆菌

39、JM109 以实现文库质粒的分离以实现文库质粒的分离1.3 单一文库质粒的扩增和纯化单一文库质粒的扩增和纯化1.4 单一文库质粒自主激活报告基因的检测单一文库质粒自主激活报告基因的检测 1.5 相互作用蛋白的进一步确证相互作用蛋白的进一步确证一对一回复性杂交一对一回复性杂交1.6 单一文库质粒插入片段的单一文库质粒插入片段的cDNA序列测定序列测定1.7 相互作用蛋白相互作用蛋白cDNA序列同源性分析序列同源性分析 Fig1 Restriction analysis of the PCR products of the frozen strain by AluLane114:the restr

40、eaked frozen strain 4,6,3,11,22,12,15,10,14,16,17,18,21,23 PCR products/Alu 2 结果结果2.1 阳性候选克隆的分组情况阳性候选克隆的分组情况 Fig2 Restriction analysis of the same PCR products of the frozen strain by Hae Lane114:the restreaked frozen strain 4,6,3,11,22,12,15,10,14,16,17,18,21,23 PCR products/Hae Fig 3 8 PCR band ty

41、pes of plasmid extracts of JM109 transformed by yeast plasmid extracts of the restreaked frozen strainsLane 18:PCR product of 4,21,11,12,6,14,17,16 transformed JM109 clones respectively 2.2 酵母质粒抽提物转化酵母质粒抽提物转化JM109 Fig 4 -galactosidase assays of AH109 transformed by library plasmids1:4#;2:6#;3:11#;4:

42、12#;5:14#;6:16#;7:17#；8:21#；N:negative control；P:positive control 2.3 单一文库质粒对单一文库质粒对AH109自主激活实验自主激活实验 Fig 5 -galactosidase assays of AH109 co-transformed by library plasmids and pGBKT7-HCK plasmids 1:4#;2:6#;3:11#;4:12#;5:14#;6:16#;7:17#；8:21#；N:negative control；P:positive control 2.4 一对一回复性杂交实验一对一回

43、复性杂交实验 2.5 AD/文库质粒插入片段文库质粒插入片段cDNA序列测定结果序列测定结果 及其同源性分析及其同源性分析 Fig6 Partial sequence of pACT2-16-1 plasmids 克隆号克隆号 实际插入片段长度实际插入片段长度 同源性分析同源性分析 4-1 491 bp 该片段该片段16460 bp与人泛素与人泛素52氨基酸融合蛋白氨基酸融合蛋白 cDNA 37481 bp 100%同源同源 6-1 291 bp 该片段该片段16250 bp与人与人CK2亚基亚基cDNA 8931127 bp 99%同源同源 11-1 699 bp 该片段该片段13663 b

44、p与人核酸酶敏感元件结合蛋白与人核酸酶敏感元件结合蛋白1 cDNA 8391489 bp 100%同源同源 12-1 543 bp 该片段该片段16514 bp与类似人与类似人NADH脱氢酶脱氢酶4 cDNA 11741672 bp 99%同源同源 21-2 408 bp 该片段该片段16366 bp与人染色体与人染色体7上的上的BAC 克隆克隆 RP11-634H22 cDNA 2557125221 bp 100%同源同源 Results of DNA sequencing and homologous analysis 14-1 263 bp 该片段该片段29234 bp与人核糖体蛋白与人

45、核糖体蛋白L37a cDNA 130335 bp 100%同源同源 16-1 427 bp 该片段该片段16406 bp与人转换蛋白与人转换蛋白1 cDNA 13403 bp 100%同源同源 17-1 1120 bp 该片段该片段1181094 bp与人染色体与人染色体19上的上的LLNLR-278H5 克隆克隆 cDNA64405464 bp 99%同源同源3 讨论讨论 3.1 AD/文库质粒及其与文库质粒及其与BD质粒的分离质粒的分离3.2 酵母双杂交系统的假阳性分析酵母双杂交系统的假阳性分析3.3 筛选到的筛选到的8种相互作用蛋白的功能及其与蛋白激酶种相互作用蛋白的功能及其与蛋白激酶

46、CK2 的关系的关系 第三部分第三部分 用用GST-pull down 进一步证实蛋白质间进一步证实蛋白质间的相互作用的相互作用 CK2Experimental Control(GST-Fusion)(GST)GSTTP1GSTGSTTP1GSTWashSDS-PAGEGST沉降示意图沉降示意图1 原理原理CK2CK2pACT2-16-1质粒和质粒和pGEX-4T-1载体的双酶切和定向重组载体的双酶切和定向重组 重组子转化大肠杆菌重组子转化大肠杆菌重组质粒的筛选重组质粒的筛选重组质粒的酶切鉴定及测序重组质粒的酶切鉴定及测序重组的蛋白激酶重组的蛋白激酶CK2亚基亚基体外表达获得的体外表达获得的G

47、ST-TP1融合蛋白融合蛋白加入到蛋白结合加入到蛋白结合缓冲液中室温孵育缓冲液中室温孵育加入已平衡的谷胱甘肽琼脂糖珠，室温孵育加入已平衡的谷胱甘肽琼脂糖珠，室温孵育蛋白结合缓冲液洗涤，除去非特异结合蛋白蛋白结合缓冲液洗涤，除去非特异结合蛋白SDS-PAGE分析分析同时设立同时设立GST作为作为阴性对照阴性对照2.2.3 GST融合蛋白沉降实验融合蛋白沉降实验Fig 7 The screening of recombinant human transition protein 1 transformants Clone 17,915 are positive clones;Clone 8 is

48、a vector plasmid 3.3 GST-TP1融合蛋白的原核表达融合蛋白的原核表达Fig 9 SDS-PAGE of the expressed recombinant human GST-TP1 in the transformed bacteriaLane 1:soluble fraction of lane 3;Lane 2:precipitated fraction of lane 3；Lane 3:crude extract of IPTG-induced bacteria transformed by pGEXGST-TP1;Lane 4:crude extract of

49、 bacteria transformed by pGEXGST-TP1 that wasnt induced by IPTG;M:protein molecular weight standardCK2GST-TP1GST Fig 10 GST pull down assay M:protein molecular weight standard Lane 1:GST Lane 2:GST-TP1+CK2 Lane 3:CK2v本研究有待于进一步研究的方向：本研究有待于进一步研究的方向：用免疫共沉淀、细胞内共定位分析等方法进用免疫共沉淀、细胞内共定位分析等方法进 一步确定上述经酵母双杂交筛选

50、出的相互作一步确定上述经酵母双杂交筛选出的相互作 用蛋白用蛋白 通过对相互作用蛋白的原核表达及其纯化并通过通过对相互作用蛋白的原核表达及其纯化并通过 激酶反应等来确定其是否为激酶反应等来确定其是否为CK2的磷酸化底物的磷酸化底物 研究研究CK2与与TP1之间的功能关系，进一步之间的功能关系，进一步 阐明在精子发生中的作用机制及其意义阐明在精子发生中的作用机制及其意义 小结小结 经人睾丸经人睾丸cDNA文库质粒转化感受态的文库质粒转化感受态的AH109 （pGBKT7-HCK）细胞，初步筛选获得）细胞，初步筛选获得138 个阳性候选克隆个阳性候选克隆 经进一步确证和分组，从经进一步确证和分组，从

51、124号阳性候选克隆号阳性候选克隆 中筛选出中筛选出8种与蛋白激酶种与蛋白激酶CK2相互作用蛋白相互作用蛋白 成功地将成功地将8种在大肠杆菌分离得到的文库质粒种在大肠杆菌分离得到的文库质粒 单独转化单独转化AH109，并排除了文库质粒本身对，并排除了文库质粒本身对 AH109菌株的自主激活活性菌株的自主激活活性 将上述将上述8种文库质粒与种文库质粒与BD质粒共转化质粒共转化AH109以以 实现一对一回复性杂交，最后证实都表现出有实现一对一回复性杂交，最后证实都表现出有 相互作用相互作用成功测出成功测出8种相互作用蛋白插入片段的种相互作用蛋白插入片段的cDNA序序 列，并确定了其名称。列，并确定了其名称。细胞内及细胞外实验都证实蛋白激酶细胞内及细胞外实验都证实蛋白激酶CK2 与人转换蛋白与人转换蛋白TP1之间有相互作用之间有相互作用