免疫组化显色系统

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1、 免疫组化显色系统免疫组化显色系统Visualization Systems ofImmunohistochemistry(IHC)免疫组化技术原理 用标记物或显色物标记抗体或抗原 通过免疫学中的抗原与已知抗体反应来检测组织或细胞内的抗原成分 免疫组化染色是一项综合性技术 组织材料的准备 免疫组化染色前处理 免疫组化染色(一抗,显色系统)免疫组化原理图标注解一抗 1一抗 2抗兔二抗抗鼠二抗组织抗原1抗原2过氧化物酶碱性磷酸酶双染阻断剂显色剂(棕色)显色剂(红色)葡聚糖骨架分子回顾过去直接法直接法二步间接法二步间接法三步间接法三步间接法酶免疫复合物法酶免疫复合物法链亲和素链亲和素-生物生物素法素

2、法(ABC)ABC)目前常用的显色系统 一步法:EPOS(Enhanced Polymer One-Step Staining)二步法:EnVision Systems 双染:General Doublestain 三步法:LSAB (Labeled Sstreptavidin-biotin)催化放大系统:CSA(Catalyzed Signal Amplication System)动物研究试剂盒:ARK(Animal Research Kit)一步法EPOS 原理:在一抗上通过多聚骨架标记过氧化物酶.即一抗上已标记过氧化物酶.这种一抗与抗原结合后即可直接显色.多聚骨架分子特异性一抗组织抗原

3、过氧化物酶一步法EPOS 主要实验流程组织片脱蜡,水化阻断(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗/HRP(U)TBS冲洗(S1968)显色剂 DAB或AEC(K3467或K0697)水漂洗素木精复染(S3309)一步法EPOS特点:一抗孵育后直接显色即用型试剂快速(一步)完成敏感性较差昂贵使用对象:要求快速出结果的免疫组化实验对象二步法EnVision 原理:在葡聚糖大分子上标记二抗及酶,将传统的二抗和三抗(酶)连接在一起,形成一个复合物EnVision.两步孵育完成免疫组化.二步法EnVision 原理图一抗与抗原结合EnVision二抗复合物与一抗结合二步法EnVision 主要实验流

4、程阻断内过氧化酶(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗孵育(Mo.Rb.)EnVision(Mo.K4001 Rb.K4003)TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(K3467或K0697)苏木精复染(S3309)TBS冲洗(S1968)二步法EnVision 特点:二抗及酶通过葡聚糖连成一个大分子试剂(避开了传统的生物素与链亲和素结合),不受内源性生物素干扰.即用,方便,快速(两步).敏感性强.背景低.是目前最理想的免疫组化显色系统 使用对象 可向所有做免疫组化的用户推荐.EnVision二步法双染原理:与EnVision二步法原理相同,只是为达到在同一组织上标记两种抗原.必需用

5、两种动物来源的一抗(常用抗小鼠和兔),分别配相应的EnVision(二抗),再用两种颜色的显色剂显色.EnVision二步法双染 原理图鼠一抗接抗原1鼠EnV/HRP接抗鼠一抗DAB(显色剂1)双染阻断剂兔一抗接抗原2兔EnV/AP接抗兔一抗Fast Red(显色剂2)EnVision二步法双染主要实验流程阻断内过氧化酶(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗(1 Mo.)孵育TBS冲洗(S1968)EnVision/HRP(1 Mo.)TBS冲洗(S1968)显色剂 1 DAB(K3467)蒸馏水冲洗双染阻断剂(Kit含)一抗(2 Rb.)孵育TBS冲洗(S1968)EnVision/AP

6、(2 Rb.)TBS冲洗(S1968)显色剂 2Fast Read(K0597)蒸馏水冲洗苏木精复染(S3309)EnVision二步法双染特点:即用,方便,快速,省时.敏感性强.背景低.在同一组织切片上,用两种不同标记物标记两种不同的抗原.使用对象 需在同一张切片上标记两种抗原者 主要是形态学科研人员三步法三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin)原理:应用生物素标记二抗与过氧化物酶或碱性磷酸酶标记链亲和素(Streptavidin)的亲和作用,连接一抗及抗原,形成大分子.再通过相应酶的底物(显色剂)作用使之显色.三步法三步法 LSAB (Labeled S

7、treptavidin-biotin)原理图:一抗与抗原结合二抗/Bio与一抗结合STPA/HRP(AP)与二抗/Bio结合三步法三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin)主要实验流程 阻断内过氧(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗孵育(Mo.Rb.)TBS冲洗(S1968)TBS冲洗(S1968)二抗/生物素 (Mo.E354 Rb.E353)TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(K3467或K0697)Fast Read(K0597或K0699)苏木精复染(S3309)链亲和素/HRP或AP蒸馏水冲洗三步法三步法 LSAB (Labeled

8、Streptavidin-biotin)特点:便宜 有现成的兔,鼠,羊通用试剂盒 会有内源性生物素造成的非特异性背景使用对象可向所有做免疫组化的用户推荐.催化放大系统催化放大系统CSA(Catalyzed Signal Amplication System)原理 在经典三步法免疫组化放大基础上,通过生物素化酪胺的催化,将又一次加入的酶标记链亲和素(Streptavidin-enzyme)与二抗中生物素亲和,使已放大的分子再一次放大.催化放大系统催化放大系统CSA(Catalyzed Signal Amplication System)原理图一抗与抗原结合二抗/Bio与一抗结合STAV/Bio与

9、二抗/Bio结合放大液催化加入STAV/HRP与Bio再结合催化放大系统催化放大系统CSA(Catalyzed Signal Amplication System)主要实验流程:阻断内过氧(S2001)水洗TBS冲洗(S1968)二抗孵育(Rb a-Mo/Bio)TBS冲洗(S1968)放大液(Kit含)链亲和素/生物素 Strep./Bio(Kit含)TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(Kit含)苏木精复染(S3309)链亲和素/过氧化物酶 Strep./HRP(Kit含)蒸馏水冲洗蛋白阻断剂(Kit含)一抗孵育(Mo)TBS冲洗(S1968)TBS冲洗(S1968)TBS冲洗(S

10、1968)催化放大系统催化放大系统CSA(Catalyzed Signal Amplication System)特点:敏感性极强 实验步骤较多 较贵使用对象:需做免疫组化实验者,特别适用于某些石蜡片不易出结果的一抗.动物研究试剂盒动物研究试剂盒 ARK(Animal Research Kit)原理 在一抗与组织抗原反应之前:小鼠一抗F(c)与生物素化抗小鼠F(ab)片断结合,再加入小鼠免疫球蛋白,中和未被结合的生物素化抗小鼠F(ab).用该复合物再与小鼠组织中特异抗原反应,可降低非特异性背景.动物研究试剂盒动物研究试剂盒 ARK(Animal Research Kit)原理图小鼠一抗抗小鼠I

11、gF(ab)/Bio免疫复合物/Bio和游离抗小鼠Ig F(ab)/Bio免疫复合物/Bio和游离抗小鼠Ig F(ab)/Bio小鼠Ig免疫复合物/Bio和被中和的抗小鼠Ig F(ab)/Bio与组织抗原结合按LSAB法继续免疫组化染色动物研究试剂盒动物研究试剂盒 ARK(Animal Research Kit)主要实验步骤 一抗与组织抗原反应之前需做试剂的预处理:小鼠一抗+抗小鼠Ig的F(ab)/Bio复合物 1复合物 1+小鼠Ig 复合物 2(已优化的一抗)用复合物2作为一抗同LSAB三步法免疫组化染色动物研究试剂盒动物研究试剂盒 ARK(Animal Research Kit)特点 小鼠一抗在小鼠组织切片上做免疫组化可降低背景.使用对象 需用小鼠一抗做小鼠组织的免疫组化实验者.几种显色系统复杂与敏感性比较目前最实用的显色系统目前最实用的显色系统 EnVision System EnVision+/Mo (K4000 K4001 GK400105)EnVision+/Rb (K4002 K4003 GK400305)EnVision Mo/Rb HRP(k1390 K1392 GK139305)EnVision Mo/Rb AP (K1396 k4016)