干细胞与组织工程课件

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1、1 1）饲养层饲养层l饲养层是用特定细胞，如成纤维细胞、输卵管上皮细胞、饲养层是用特定细胞，如成纤维细胞、输卵管上皮细胞、子宫上皮细胞等，经丝裂霉素子宫上皮细胞等，经丝裂霉素C阻断有丝分裂处理后制成阻断有丝分裂处理后制成的细胞单层。的细胞单层。l常用的饲养层细胞有常用的饲养层细胞有3种种：一种已成系的小鼠胎儿成纤维细胞（一种已成系的小鼠胎儿成纤维细胞（STO）原代小鼠胎儿成纤维细胞（原代小鼠胎儿成纤维细胞（PMEF）同源小鼠胎儿成纤维细胞（同源小鼠胎儿成纤维细胞（HEF）l作用作用：促进全能性（或多能性）细胞的增殖和抑制其分化：促进全能性（或多能性）细胞的增殖和抑制其分化2 2）分化抑制因子分

2、化抑制因子lES细胞的分化抑制是多种因子共同作用的结果，其中细胞的分化抑制是多种因子共同作用的结果，其中起主导作用的是白血病抑制因子（起主导作用的是白血病抑制因子（LIF/DIA）lLIF是一种天然的细胞因子，因其能诱导小鼠白血病是一种天然的细胞因子，因其能诱导小鼠白血病细胞分化而得名，具有广泛的生物学特性。细胞分化而得名，具有广泛的生物学特性。lLIF在体外具有诱导一种髓样白血病细胞在体外具有诱导一种髓样白血病细胞M1细胞向正细胞向正常分化和抑制胚胎干细胞自主分化能力，并且能够促常分化和抑制胚胎干细胞自主分化能力，并且能够促进进8细胞以后的桑葚胚至着床前胚胎的发育，提高囊细胞以后的桑葚胚至着

3、床前胚胎的发育，提高囊胚的存活率，促进滋养层细胞增殖和内细胞团生长。胚的存活率，促进滋养层细胞增殖和内细胞团生长。3 3）条件培养基条件培养基l作用：作用：v 具有消除饲养层细胞干扰、免受致癌剂丝裂霉素具有消除饲养层细胞干扰、免受致癌剂丝裂霉素C影响、影响、操作简便等优点，可以进一步分析操作简便等优点，可以进一步分析ES细胞分化的启动和关细胞分化的启动和关闭机制。闭机制。l常用的条件培养基：常用的条件培养基：Buffalo大鼠肝细胞（大鼠肝细胞（BRL），大鼠心），大鼠心 肌细胞，人膀胱癌细胞株肌细胞，人膀胱癌细胞株5637（HBC）l原理：原理：v 通过培养细胞分泌到培养基中的生长因子，刺激

4、全能性通过培养细胞分泌到培养基中的生长因子，刺激全能性（或多能性）细胞增殖和抑制分化。（或多能性）细胞增殖和抑制分化。ES细胞的分离培养细胞的分离培养l常规培养液为含有常规培养液为含有白血病细胞抑制因子（白血病细胞抑制因子（LIF）、胎牛血胎牛血清清、L谷氨酸、非必需氨基酸（谷氨酸、非必需氨基酸（NEAA）、丙酮酸盐、）、丙酮酸盐、巯基乙醇巯基乙醇、谷氨酰胺、高浓度葡萄糖的、谷氨酰胺、高浓度葡萄糖的DMEM培养基，培养基，以及以及EGF，IGF和胰岛素等生长因子。和胰岛素等生长因子。l巯基乙醇巯基乙醇是一种还原剂，可使血清的含硫化合物还原是一种还原剂，可使血清的含硫化合物还原成谷胱苷肽，以消除

5、细胞培养中产生的过氧化物的毒害作成谷胱苷肽，以消除细胞培养中产生的过氧化物的毒害作用，同时其还可以促进用，同时其还可以促进DNA合成，具有诱导细胞增殖和促合成，具有诱导细胞增殖和促进胚胎贴壁的作用。进胚胎贴壁的作用。ES细胞的鉴定细胞的鉴定生产克隆动物生产克隆动物生产转基因动物生产转基因动物l生产用于人类器官移植的动物器官，建立人类生产用于人类器官移植的动物器官，建立人类遗传病研究动物模型遗传病研究动物模型：克服异体免疫排斥反应；：克服异体免疫排斥反应；定向诱导人类定向诱导人类ESES细胞分化，形成供移植的人体器细胞分化，形成供移植的人体器官；将人的基因导入猪等动物官；将人的基因导入猪等动物E

6、SES细胞，生产含人细胞，生产含人基因猪。基因猪。l家畜性别控制家畜性别控制l作为胚胎发育的模型，研究胚胎发育的基因调控作为胚胎发育的模型，研究胚胎发育的基因调控l研究真核细胞基因表达与调控：研究真核细胞基因表达与调控：利用转基因技术研究动利用转基因技术研究动物内分泌功能的关系；利用基因定位技术可以研究肿瘤的物内分泌功能的关系；利用基因定位技术可以研究肿瘤的形成过程；利用基因定位技术研究激素与调控生物发育基形成过程；利用基因定位技术研究激素与调控生物发育基因的关系。因的关系。l研究外源基因在动物发育中的作用研究外源基因在动物发育中的作用l研究细胞分化的机制研究细胞分化的机制l在脑修复中的作用在

7、脑修复中的作用l来源于一个组织的成体干细胞除了能分化为该组织的细胞来源于一个组织的成体干细胞除了能分化为该组织的细胞外，在特定的条件下还具有被诱导分化成为另一种组织的外，在特定的条件下还具有被诱导分化成为另一种组织的功能性细胞，即一种组织的成体干细胞仍然具有跨越组织功能性细胞，即一种组织的成体干细胞仍然具有跨越组织或胚层、分化为其他类型细胞的多潜能，这种成体干细胞或胚层、分化为其他类型细胞的多潜能，这种成体干细胞具有跨越组织或胚层分化的特性称为成体干细胞的具有跨越组织或胚层分化的特性称为成体干细胞的可塑性可塑性(Plasticity)或或横向分化（横向分化（transdifferentiati

8、on）l成体干细胞在一定的微环境中，可以成体干细胞在一定的微环境中，可以横向分化横向分化成为需要的成为需要的细胞和组织，从而起到治疗作用。细胞和组织，从而起到治疗作用。l可以从自体中分离初成体干细胞，在体外可以从自体中分离初成体干细胞，在体外定向诱导定向诱导分化为分化为特定组织细胞，再将这些细胞回输人体内，从而达到长期特定组织细胞，再将这些细胞回输人体内，从而达到长期治疗的目的。治疗的目的。l该方法的应用有助于避免使用胚胎干细胞带来的伦理学问该方法的应用有助于避免使用胚胎干细胞带来的伦理学问题，在干细胞领域具有革命性意义。题，在干细胞领域具有革命性意义。l在医学中在医学中,可利用成体干细胞于创

9、伤修复可利用成体干细胞于创伤修复,疾病的细胞治疗疾病的细胞治疗,整形外科学和组织工程学等需要。整形外科学和组织工程学等需要。l组织工程的概念、原理组织工程的概念、原理l组织工程的研究内容组织工程的研究内容l组织工程学的研究概况组织工程学的研究概况l组织工程的展望组织工程的展望l组织工程组织工程(Tissue Engineering，TE)：应用生命科学与：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织或

10、器官损伤后的发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。l基本原理和方法基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种具有优良细胞相容性并可被机体降解吸收的生物材料一种具有优良细胞相容性并可被机体降解吸收的生物材料上形成复合物，然后将细胞上形成复合物，然后将细胞生物材料复合物植入人体生物材料复合物植入人体组织、器官的病损部位，在作为细胞生长支架的生物材料组织、器官的病损部位，在作为细胞生长支架的生物材料逐渐被机体降解吸收的同时，细胞不断增殖、分化，形成逐渐被机体降解吸收的

11、同时，细胞不断增殖、分化，形成新的并且其形态、功能方面与相应组织、器官一致的组织，新的并且其形态、功能方面与相应组织、器官一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的。从而达到修复创伤和重建功能的目的。l组织工程的核心组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，这与传统的二维结构（如细胞培养）有着本质的复合体，这与传统的二维结构（如细胞培养）有着本质的区别，其最大优点是可形成具有生命力的活体组织，对病区别，其最大优点是可形成具有生命力的活体组织，对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代；损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替

12、代；用最少的组织细胞通过在体外培养扩增后，进行大块组织用最少的组织细胞通过在体外培养扩增后，进行大块组织缺损的修复；可按组织器官缺损情况任意塑形，达到完美缺损的修复；可按组织器官缺损情况任意塑形，达到完美的形态修复。的形态修复。l器官保存培养：维持器官的存活与功能器官保存培养：维持器官的存活与功能l组织培养：体外培养生成某些组织组织培养：体外培养生成某些组织l组织修复：通过培养组织、移植或原位地进行坏组织修复：通过培养组织、移植或原位地进行坏损组织的修复。损组织的修复。l组织工程研究主要包括四个方面：组织工程研究主要包括四个方面：种子细胞种子细胞、生生物材料物材料、构建组织和器官的方法和技术构

13、建组织和器官的方法和技术以及以及组织组织工程的临床应用工程的临床应用 l种子细胞的培养是组织工程的基本要素，细胞主要来源于自种子细胞的培养是组织工程的基本要素，细胞主要来源于自体、同种异体、异种组织细胞等。体、同种异体、异种组织细胞等。l自体组织细胞应为首选。由于组织工程细胞培养多需要高浓自体组织细胞应为首选。由于组织工程细胞培养多需要高浓度的细胞接种，自体组织细胞存在着数量上的局限性及长期度的细胞接种，自体组织细胞存在着数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题。传代后细胞功能老化的问题。l现在的研究多集中于以下的几个方面：现在的研究多集中于以下的几个方面：u 载体等技术用于细胞的快速增殖

14、载体等技术用于细胞的快速增殖u干细胞工程干细胞工程 u 采用各种生长因子和端粒酶调节与延缓细胞的老化采用各种生长因子和端粒酶调节与延缓细胞的老化u 采用各种方法诱导细胞发生转化，使其倍增时间减少，采用各种方法诱导细胞发生转化，使其倍增时间减少，永生化或生命期延长，也是一个努力方向。永生化或生命期延长，也是一个努力方向。l但是要建立适于组织工程需要的种子细胞，需要解决以下但是要建立适于组织工程需要的种子细胞，需要解决以下问题：问题：增加细胞的增殖能力；增加细胞的增殖能力；延长细胞的生命期；延长细胞的生命期；提高细胞的分泌能力；提高细胞的分泌能力；优选不同组织来源的同一功能的优选不同组织来源的同一

15、功能的最佳细胞；最佳细胞；建立标准细胞系，使研究工作有更好的可比建立标准细胞系，使研究工作有更好的可比性和科学性；性和科学性；同种异体与异种移植的免疫学；同种异体与异种移植的免疫学；细胞与细胞与人工细胞外基质的相互作用及影响因素。人工细胞外基质的相互作用及影响因素。l细胞外基质（细胞外基质（extracelluarmatrix，ECM），生物相容性），生物相容性好、可被人体降解吸收的组织工程支架材料。好、可被人体降解吸收的组织工程支架材料。l其功能其功能是为细胞提供生存空间，使细胞获足够的营养物质，是为细胞提供生存空间，使细胞获足够的营养物质，进行气体交换，并使细胞按预制形态的三维支架生长。在

16、进行气体交换，并使细胞按预制形态的三维支架生长。在细胞和生物材料的复合体植入机体病损部位后，生物支架细胞和生物材料的复合体植入机体病损部位后，生物支架被降解吸收，但种植的细胞继续增殖繁殖，形成新的具有被降解吸收，但种植的细胞继续增殖繁殖，形成新的具有原来特殊功能和形态的相应组织器官。原来特殊功能和形态的相应组织器官。lECM包括均质状态的基质（蛋白多糖、糖蛋白）和细丝包括均质状态的基质（蛋白多糖、糖蛋白）和细丝状的胶原纤维。状的胶原纤维。ECM是细胞附着的基本框架和代谢场所，是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响所构成的组织形态和功能。其形态和功能直接影响所构成的组织形态和功能。

17、l理想的理想的ECM应具有以下特点应具有以下特点：生物相容性好，在体内生物相容性好，在体内不引起炎症反应和毒性反应；不引起炎症反应和毒性反应；有可吸收性，能彻底地被有可吸收性，能彻底地被自身组织所取代；自身组织所取代；有可塑性，可塑为任意的三维结构，有可塑性，可塑为任意的三维结构，植入后在体内仍可保持特定形状；植入后在体内仍可保持特定形状；表面化学特性和表面表面化学特性和表面微结构利于细胞的粘附和生长；微结构利于细胞的粘附和生长；降解速率可根据不同细降解速率可根据不同细胞的组织再生速率而进行调整。胞的组织再生速率而进行调整。l组织和器官的构建因应用于不同的方面，方法也不相同。组织和器官的构建因

18、应用于不同的方面，方法也不相同。但其本质都是把种子细胞与支架材料结合得到设计的组织但其本质都是把种子细胞与支架材料结合得到设计的组织或器官。或器官。l如如骨组织构建骨组织构建 构建组织工程骨的方式有几种：构建组织工程骨的方式有几种：支架材料与成骨细胞；支架材料与成骨细胞；支架材料与生长因子；支架材料与生长因子；支架材料与成骨细胞加生长因支架材料与成骨细胞加生长因子。子。l目前，用组织工程骨修复骨缺损的研究，已从取材、体外目前，用组织工程骨修复骨缺损的研究，已从取材、体外培养、细胞到支架材料复合体形成等都得到了成功。培养、细胞到支架材料复合体形成等都得到了成功。皮肤修复皮肤修复骨修复骨修复l当前

19、亟待解决的问题当前亟待解决的问题u生物学挑战：细胞和细胞源生物学挑战：细胞和细胞源u工程化挑战工程化挑战l组织工程与产业化组织工程与产业化l组织工程研究与经济发展的组织工程研究与经济发展的关系关系l 组织工程是一门新兴的交叉学科，所涉及到的研究领域组织工程是一门新兴的交叉学科，所涉及到的研究领域包括细胞生物学、免疫学、材料科学等，它是一个规模庞包括细胞生物学、免疫学、材料科学等，它是一个规模庞大的世纪工程，其意义大的世纪工程，其意义不亚于人类基因组计划不亚于人类基因组计划，只是目前，只是目前临床应用仍较少，许多问题尚未得到解决，如细胞的培养、临床应用仍较少，许多问题尚未得到解决，如细胞的培养、

20、细胞在三维空间载体材料上的健康成长、移植细胞的基因细胞在三维空间载体材料上的健康成长、移植细胞的基因表达、用于组织工程的聚合物等。表达、用于组织工程的聚合物等。l目前研制出的各种组织提取物如皮肤、软骨等都只能替代目前研制出的各种组织提取物如皮肤、软骨等都只能替代缺损组织的部分功能，而且维持时间短，离永久性功能替缺损组织的部分功能，而且维持时间短，离永久性功能替代物尚有一段距离。相信随着相关学科的不断发展，必能代物尚有一段距离。相信随着相关学科的不断发展，必能逐渐克服目前存在的问题，为临床应用展开新的篇章。逐渐克服目前存在的问题，为临床应用展开新的篇章。l淋巴因子激活的杀伤细胞淋巴因子激活的杀伤

21、细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和和自身淋巴细胞疗法自身淋巴细胞疗法(ALT)，三种疗法都用来治疗癌症。三种疗法都用来治疗癌症。lLAK细胞是取自患者血液的淋巴细胞，在体外增殖，并用细胞是取自患者血液的淋巴细胞，在体外增殖，并用白细胞介素白细胞介素2(IL2)激活，再还输给患者，这种激活，再还输给患者，这种LAK细胞细胞在患者体内就能攻击肿瘤。在患者体内就能攻击肿瘤。lTIL基本上是取自患者肿瘤的基本上是取自患者肿瘤的LAK细胞，它在抗癌细胞作细胞，它在抗癌细胞作用方面显示更大的希望，但避免应用用方面显示更大的希望，但避免应用IL2，因为，因为IL2可可引起患者水肿

22、、恶心和可能的心脏问题。淋巴细胞在体外引起患者水肿、恶心和可能的心脏问题。淋巴细胞在体外接触癌抗原，后者激发淋巴细胞的抗癌作用。接触癌抗原，后者激发淋巴细胞的抗癌作用。lALT未经增殖，就还输给患者。未经增殖，就还输给患者。l包括包括体外培养骨髓细胞体外培养骨髓细胞，包括干细胞，包括干细胞(备料血细胞的前备料血细胞的前体细胞体细胞)以及骨髓中许多白细胞和红细胞的前体细胞。以及骨髓中许多白细胞和红细胞的前体细胞。l此法均等地增殖各种细胞的数目，此法均等地增殖各种细胞的数目，扩增用于移植的骨扩增用于移植的骨髓量髓量,有可能使骨髓移植量减少到数克，而不是目前所有可能使骨髓移植量减少到数克，而不是目前

23、所需要的半升到一升。需要的半升到一升。l可增加自身骨髓移植成功的机会，缓和移植他人骨髓可增加自身骨髓移植成功的机会，缓和移植他人骨髓所引起的宿主抗体排斥反应。所引起的宿主抗体排斥反应。l其可能的应用包括为进行其可能的应用包括为进行化学疗法或放射治疗化学疗法或放射治疗两种两种治疗都能杀死骨髓细胞治疗都能杀死骨髓细胞)的患者的患者或其或其血液组织具有暴露血液组织具有暴露于环境中危害性化学品的危险者于环境中危害性化学品的危险者储存骨髓。储存骨髓。l 培养细胞制备人造组织的培养细胞制备人造组织的目的目的是用于烫伤病人的永久性是用于烫伤病人的永久性皮肤移植物及用培养组织制备血管和器官皮肤移植物及用培养组

24、织制备血管和器官l两种基本的移植物类型两种基本的移植物类型：(1)自体移植物，患者的小部分自体移植物，患者的小部分皮肤在体外培养，形成较大的皮片；皮肤在体外培养，形成较大的皮片；(2)同种异体移植物，同种异体移植物，皮肤细胞皮肤细胞(通常是成纤维细胞通常是成纤维细胞)除去免疫反应性淋巴细胞后，除去免疫反应性淋巴细胞后，用作后移植物，治疗不同的病人。用作后移植物，治疗不同的病人。l目前临床应用的自体培养法从切取皮肤标本到移植新皮肤，目前临床应用的自体培养法从切取皮肤标本到移植新皮肤，需要三星期，而同种异体移植物在烫伤治疗中心有现货供需要三星期，而同种异体移植物在烫伤治疗中心有现货供应，尚需证实同

25、种异体移植物对人体的实用性和无免疫原应，尚需证实同种异体移植物对人体的实用性和无免疫原性。性。l方法方法是从胎儿切取前胰岛细胞或前神经组织，把它们植入是从胎儿切取前胰岛细胞或前神经组织，把它们植入成人体内，供应某些缺失的生化物质。成人体内，供应某些缺失的生化物质。l例如：前胰岛细胞可望给糖尿病患者供应胰岛素，前神经例如：前胰岛细胞可望给糖尿病患者供应胰岛素，前神经细胞可产生细胞可产生5羟色胺，这是帕金森病患者所缺乏的一种羟色胺，这是帕金森病患者所缺乏的一种神经递质。神经递质。l选择胎细胞的原因是，它的免疫原性比成年细胞弱，并可选择胎细胞的原因是，它的免疫原性比成年细胞弱，并可培养和增殖。培养和

26、增殖。l这项技术是有争议的，因为实验研究通常应用取自流产胎这项技术是有争议的，因为实验研究通常应用取自流产胎儿的细胞。儿的细胞。l包裹法取自包裹法取自成年细胞成年细胞，需要防止成年细胞的免疫原性（它，需要防止成年细胞的免疫原性（它最终会引起排斥反应）。最终会引起排斥反应）。l其方法是用其方法是用聚合物基质或膜包封移植细胞聚合物基质或膜包封移植细胞，把它与接受者，把它与接受者的免疫系统分隔开采。的免疫系统分隔开采。l主要用于治疗主要用于治疗I型糖尿病，从而无需每天注射胰岛素。然型糖尿病，从而无需每天注射胰岛素。然而，对免疫原性反应的起因的疑问日益增长，从而可对包而，对免疫原性反应的起因的疑问日益

27、增长，从而可对包裹法的需要产生显著影响。裹法的需要产生显著影响。l有证据表明，只要清除或杀死胰岛中存在的大约十种不同有证据表明，只要清除或杀死胰岛中存在的大约十种不同类型的巨噬细胞，就能把一个动物的完整的成年胰岛成功类型的巨噬细胞，就能把一个动物的完整的成年胰岛成功地移植到另一个动物体内。地移植到另一个动物体内。l干细胞的概念、特点及分类干细胞的概念、特点及分类lES细胞的分离培养，分化抑制物细胞的分离培养，分化抑制物lES细胞的鉴定细胞的鉴定lES的应用前景的应用前景l成体干细胞的概念、特点及研究中存在的问题成体干细胞的概念、特点及研究中存在的问题l组织工程的概念及研究内容组织工程的概念及研究内容