Western blot实验流程

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1、Western blot一.仪器及器皿:棕色广口瓶5个（50ml)，灭菌,烧杯3个灭菌，EP管，枪及枪头,分光光度计，超声破碎机，冷冻离心机，灭菌0。9%生理盐水，冰，灭菌水（1000ml），两套灭菌器械.二。药品配制:1。TBS10（Tris Buffered Saline）:2。42 g Tris base 8g NaCl100ml H2O， 用HCl调pH 7.6 ，4C保存。(配TBST用)TBST=TBS+0。05Tween2TBS ：0.303 g Tris base 0。4383g NaCl (150mM） 0。05gSDS用HCl调pH至8。0（配裂解液用),50ml约用2.1

2、mlHCl.30.5M TrisHCl(pH6。8），50ml,：3gTrisbase加灭菌水约30ml,用6N盐酸缓缓调pH至6.8（约用1ml）,定容至50ml,4保存。(若调小了,用5.6%NaHCO3调回) 。1.5M TrisHCl（pH8。8),50ml，9。08gTrisbase加灭菌水约40ml,用6N盐酸缓缓调pH至8.8(约用2ml），定容至50ml，4保存。45Running buffer pH8。3，500ml：Tris-base 7。5g, Glycine(甘氨酸) 36g，SDS 2.5g加灭菌水至500ml, 4保存，用时若有沉淀析出可提前拿出置37，不用调pH值

3、,用时按1：5稀释，即60ml的5Running buffer加入240ml水。530%acrylamide（丙稀酰胺贮液):8.76g acrylamide， 0。24g N， N-methylenebisacrylamide（亚甲基双丙烯酰胺），加少许 灭菌H2O搅匀,最后定容至30 ml 。用0.45 m的过滤器过滤后4C避光保存610SDS：5gSDS+50 ml H2O,(难溶,需较长时间）,常温保存。7.10APS (ammonium persulfate,过硫酸铵(粉剂也保存在4C）：100mg APS +1ml H2O,EP管中即可，4C保存1周，-20C保存1个月，时间长了胶

4、难凝.8。 0.1% bromophenol blue dye溴酚蓝10ml溴酚蓝10mg加ddH2O至10ml，搅匀溶解，过滤除去未溶颗粒。9。 2Sample buffer(1:1）避光保存 10%SDS （1g/10ml) 400l 0.5M Tris(pH6.8) (0。6055g/10ml） 250l 100% Glycerol（甘油，丙三醇） 200l 2-mercaptoethanol(巯基乙醇） 100l 0.1 bromophenol blue (10mg/10ml） 80l总计1030l 避光4C保存。4Sample buffer(1:1)避光保存:10. 胶Stain S

5、olution(蛋白染液）：100mgCoomassie Brilliant Blue G 250(考马斯亮蓝)溶于50ml95%的乙醇,加入100ml 85的H3PO4，及50mlddH2O， 4C保存于棕色瓶中。Coomassie Brilliant Blue R 250（考马斯亮蓝-R250）： R250 0.5g 甲醇 225ml 定容至500ml 冰醋酸 50ml11. 胶Destain Solution(脱色液）for Coomassie Brilliant Blue:acetic acid（冰乙酸） 100mlmethanol（甲醇) 100ml加水至1000ml 。若转完膜后染

6、色则不用10及11，改用12和13。12。NC膜染色液:0。1氨基黑染液：氨基黑 0。2gmethanol(甲醇) 90ml冰醋酸 20ml加水至200ml。13NC膜脱色液：methanol(甲醇) 180ml冰醋酸 4ml加水至200ml。14配转膜液(transfer buffer）: Tris 6。06g Glycine 28.8g Methanol (甲醇) 400ml DDH2O to 2000ml，混匀后不用调pH值， 4保存。（提前将前两种配成800ml，为2transfer buffer转膜时取400ml加入400mlH2O,另加200 ml Methanol （甲醇）即可)

7、。注:所用水最好为灭菌的去离子水便于长期保存。15。Tris-Gly 电泳缓冲液（5X）Tris 15.1gGly 72。0gSDS 5。0g去离子水定容至1L，室温保存三 实验步骤。(一）提取蛋白并测蛋白浓度：1开离心机，4 C ；2。 配裂解液： 1mlTBS（pH至8。0)加入10lNP40,1lPepstatin（1g/ml）， 胃蛋白酶抑制剂A,溶于DMSO（二甲基亚枫）,-20C保存1lLeupeptin(1g/ml)， 亮抑蛋白酶肽，溶于ddH2O，-20C保存1lAprotinin(1g/ml)，抑蛋白酶肽，溶于ddH2O，20C保存。5lPMSF（100g/ml),pheny

8、l methylsulfonyl fluoride ，苯甲基磺酰氟,溶于异丙醇（isopropanol），20C保存。3拿冰置于冰盒内，裂解液配好后即放于冰水上；4用1戊巴比妥钠麻醉后取材，最好小于100mg，用冷TBS或冷生理盐水冲洗后（做蛋白最好灌流,做RNA要用70%酒喷毛,若不即用可在液氮中冷冻30min后,-70C保存），加入裂解液(100mg/ml)，放于冰上，剪碎组织；剩余裂解液仍放于冰上,以备稀释样品用;5超声破碎，小烧杯内有冰,EP管置于冰水上，稳定并降温，410s，560W，间隔10S,超至无块状即可；6离心4 C，12000g,20min离心机转动时打至time档性能稳定

9、7。蛋白定量：配标准蛋白，成倍数(根据药盒说明，有线性关系的浓度分别为0，0.15，0。3,0。6，0.9g/l ，因此0。3g/l 的标准蛋白各取0.5，1，2,3l,并加入1ml染液；震荡混匀，测标品吸光值595nm，再由低浓度向高浓度测。做标准曲线,准备蛋白定量使用。9取超声破碎好的上清放于新EP管中，放于冰水上，取1l加19l ddH2O稀释20倍,从中再取1l加入1ml染液，室温后5min，测吸光值，应在混匀后30min之内测完。10对标品用Excel做图，输入吸光值及对应浓度(包括空白），做散点图，完成图后添加趋势线，截距为0，公式及R2（相关系数）均选，得到相应公式（Y= BX）

10、,再计算浓度即可，结果应20(稀释倍数)。加样时每个孔应有50g,用50/浓度即为加样量l。样品即用可放于冰上，否则分装后放于-80。补：7-10步测定蛋白浓度，也可以用买的蛋白定量试剂盒补2：若样品为细胞样品时：(在冰上进行）（不用蛋白定量的操作）1、 六孔板长满后，用PBS洗3遍，用裂解液和2X buffer1:1混匀的液体加入每孔100ul左右裂解。然后用刮刀刮下来，没刮一个孔要在三次水中洗一下刮刀。2、 煮30min,95.-20保存。用的时候拿出来化，离心取上清。（需要蛋白定量的操作)1、 裂解用液为： 裂解液：抑制剂 = 1:1。收完蛋白后先离心，1000r/min，离心8min。

11、吸出上清,弃掉沉淀.2、 96孔板，水 + 标准品（BSA，2mg/ml）总共20ul 蛋白（4ul) + 水（16ul） 20ul 0 19ul 1 18ul 2 16 4 14 6 12 8 10 10所有孔（即每孔）加100ul显色剂（BCATM:BCA) = 1：50混合），注意避光3、37孵育40min4、王黎明的程序里有BCA的程序测定(最后的配平用液也是裂解液：抑制剂=1:1)5、定量的同时，同体积的蛋白和2Xbuffer一起煮30min，95。20保存。蛋白分子量范围分离胶凝胶浓度（%）5000002-5（二）电泳（SDSpolyacrylamide gel electroph

12、oresis)1 检查电泳所需的各种试剂和器械，并从4拿出药品；2 清洗电泳所用的玻璃板（平时浸泡于洗洁精液中）,擦酒精(70%),晾干或60-70烤干；3 装置电泳玻璃板（长板在内短板在外）并固定（卡住）；4 配胶:之前先用水检查是否漏胶，两片玻璃要对齐,以免漏胶。 1.5mm玻璃板用7ml，1mm的玻璃板用5ml分离胶浓缩胶68%7.5%101245% （2ml）5%（5ml）ddH2O2.62。32。42ml1.576ml1.68ml1。2ml1。4ml3。5ml30%Acrylamide(4避光)11。31。25ml1.36ml2ml0.27ml0。33ml0。825ml1.5M Tr

13、isHCl(pH8。8)1。31。31.25ml1。00ml1。25ml-0.5 M TrisHCl(pH6。8)-0。5ml0.25ml0.625ml10%SDS505050l40l50l20l20ul50ul10%APS(后加)505050l40l25l20l 20ul50ulTEMED(后加)432.5l2.0l2。5l2l2ul5ulToTal5ml5ml5ml4ml2mlAPS（先加） 和TEMED要最后用时再加，混匀,每边用枪从板左上角加入4ml，枪头内胶不要全推出，即再吸再加入，防止出气泡,加胶比5cm的刻度线稍高,用去离子水或乙醇滑行方式加满覆盖压住胶（因为只在一角加入会使胶面

14、不平）,使凝固（水封下出现折光面)，约0.5-1h，除去水层，用水冲洗2次，并用滤纸吸干残留的水分；等约30min。加入浓缩胶,每边加满，立即插上梳子（平整面朝内，先一端插入，缓慢斜放至另一端插入）注意不要有气泡，可用70%酒精排出；等30min左右。加完浓缩胶立刻开始准备样品，并打开水浴锅,100;胶凝后（可见齿边缘与胶有空隙)垂直拔出梳子，两边同时用力；先用去离子水冲洗加样孔，再用Running buffer冲洗；5准备样品,每孔使用总蛋白量50微克,计算使用的样本量，根据loading buffer的浓度，加样量为10l,即样本量（50/浓度）用裂解液补充总体积至5l再加入5l Samp

15、le buffer （2），另有marker 和一个Sample buffer(1），上样时加在一侧（防止跑歪）,也可不用.（先加水，再加5l Sample buffer，最后加蛋白），加完后离心再100水浴5min后放于冰上，准备上样. 两边两道buffer，左边一道marker。6放好电泳槽,将制好的胶板反过来（短面在内，如果跑单面胶,则放置好胶板后，另一面放塑料板，字面向内,夹紧）,外加旧缓冲液Running buffer，两板之间加入稀释5倍的新缓冲液Running buffer(约用150ml,即35ml5+140ml水）。上样.浓缩胶时80V，30min，分离胶时120V，45mi

16、n（等条带齐了就可以换电压了）。（若在冰盒中电泳，时间可稍延长，但是浓缩胶一定要跑完才可以变电压再跑分离胶)。(三）电泳转膜（冰上进行）1溴酚兰快达底部即可停止电泳；2（切下Marker及样品1、 2、3的胶,用Coomassie Brilliant Blut G(考马斯亮蓝)染色约30min(摇床）后用Destain脱色液脱色2h，并于凝胶成像中观察)此步可省，可在转完膜后，将膜剪下再用氨基黑染色(或者丽春红染色)；3。配转膜液1000ml：取400ml 2transfer buffer加入400mlH2O，另加200 ml Methanol (甲醇)即可;再加入1ml10SDS利于转膜;或

17、者10X转膜液：甲醇：双蒸水=1:2:7.4。 PVDF 膜预处理：用甲醇浸泡1minddH2O 3个5min转膜液浸泡15minNC膜（nitrocellulose membrane，硝酸纤维素膜）（8。55.5cm）直接用转膜液浸泡10min切4张8.85.8cm滤纸(Whatman 3mm层析纸），与海绵垫均用转膜液浸泡10min；切除浓缩胶(记清方向及要剪下染全蛋白的膜长度，并用铅笔标记于NC膜上)，将胶于转膜液中浸泡10min；5 摆放顺序夹子黑色面+海绵（聚乙烯板)+2滤纸+凝胶(剪左角）+NC膜(不分正反面）+2滤纸+海绵+夹子白色面（三明治）,注意每放一层用玻璃棒赶一次气泡，并

18、要始终保持湿润，否则胶易碎;将三明治固定在转膜槽内,且夹子黑色面对转膜槽黑色面；一定要赶净气泡，否则会产生高背景或影响蛋白转移。6 PVDF膜要在甲醇中浸没1-2min，然后在缓冲液中浸没5min再用。膜总是对着红色的那端。6。转膜250mA，1.5h;电泳仪调至恒流（mA)；注意：三明治放于电泳盒内，并于盒底部放一磁力转子，三明治和盒壁间放置一冰盒进行转膜;放于有冰块的小盆内，放于磁力搅拌器上,中速； 7。拿出PVDF膜，并剪去一角做标记；（可以在转膜前就剪角）8。将Marker及样品剪下用氨基黑（丽春红）染色10min，再用脱色液脱色至背景干净为止（摇床，加盖），放于凝胶成像中用可见光观察

19、。（四）与抗体结合：1将250mlTBS (25mlTBS10+225ml灭菌的去离子水）+125l Tween20配置成含0.05%T的TBST，洗膜，5min/次,3次；注：洗时转速较快，但奶粉封闭及一抗、二抗要用最慢或稍快的速度,否则结合不上;2。TBST配置5%的脱脂奶粉封闭液10ml，室温摇床封闭11.5h；封闭后用TBST洗15min+5min+5min3。加入一抗，先摇床轻摇动20min，然后放置4过夜。4。 TBST洗膜15min+5min+5min;5.加入1：5000二抗,室温摇动孵育1h；6. TBST洗膜15min+5min+5min+5min；7化学发光.8。 将PVDF膜保存在4，备用。9用较多的TBST再次洗膜,10min+10min;10.5%脱脂奶粉室温封闭1h.可再进行免组。