激光细胞融合术课件

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1、激光细胞融合术激光细胞融合术 1研究目的和意义研究目的和意义2发展历史发展历史3讨论与分析讨论与分析4主要特点主要特点5应用应用主要内容主要内容1.细胞融合的目的和意义细胞融合的目的和意义w细胞融合细胞融合是指利用化学化学或物理物理方法把两个两个或多个紧连多个紧连的细胞融合成一个一个细胞的技术，也称为体细胞杂交体细胞杂交，是细胞工程的重要内容之一，是一种在细胞水平上的遗传操纵。w 细胞融合有别于有别于将一个细胞的细胞核移入同种或异种去核成熟卵内的核移植技术核移植技术。细胞融合的目的和意义细胞融合的目的和意义 w 细胞融合能把亲缘关系较远，甚至毫无亲缘关系的生物体细胞融合在一起，为远缘杂交远缘杂

2、交架起了桥梁，是改善细胞遗传物质的有力手段。w 它的意义在于从此打破打破了仅仅依赖有性有性杂交杂交重组基因创造新种重组基因创造新种的界限，扩大扩大了遗传物质的重组范围重组范围。融合方法w 病毒融合法病毒融合法w 聚乙二醇聚乙二醇 （PEGPEG）法）法w 电融合法电融合法w 微束激光融合法微束激光融合法病毒融合法一般过程聚乙二醇聚乙二醇 （PEGPEG）法）法一般过程w 一般是用人工人工的方法，即利用各种融合剂融合剂如：仙台病毒或聚乙二醇(PEG)等，把两个邻接的细胞界膜溶解掉细胞界膜溶解掉，使二个或二个以上的细胞合并成一个细胞合并成一个细胞。最初两个细胞只有胞浆合在一起，核各自独立，这种细胞

3、叫异型核合异型核合胞体胞体。经过培养，通过有丝分裂有丝分裂两种亲细胞的染色体才彼此混合在一起，分到两个子细胞核里去，再经过胞浆的分裂，变成两个单单核杂交细胞核杂交细胞(见图)。电 气 穿 孔 法 细 胞 融 合细胞在融合过程中的主要变化：w 呈致密状态致密状态的体细胞在促融合剂促融合剂的作用下，细胞膜的性质发生变化；w 首先，出现细胞凝集凝集现象；然后，部分凝集细胞之间的膜膜发生粘连粘连；w 继而，融合融合形成多核细胞；细胞在融合过程中的主要变化：w在培养过程中多核细胞多核细胞又进行核的核的融合融合而成为单核单核的杂种细胞杂种细胞w而那些不能形成单核不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐渐死亡死

4、亡。融合结果w 细胞融合的结果是一个细胞含有两个两个或多个多个细胞核，这细胞称为多核体多核体。w 如果细胞中所含有的核,只来自一种亲本一种亲本型型，就称为同核体同核体。w 如果细胞中所含有的核,来自两种亲本型两种亲本型，就称为异核体异核体。以往方法的缺点w 以前建立的各种病毒、化学融合病毒、化学融合的方法，无法实现无法实现所选定的细胞间的特异融合特异融合，且化学融合剂有毒有毒，需要用紫外光消毒。以往方法的缺点w 电融合电融合技术把细胞聚集接触和膜结构扰动及融合分为两步，使特异性融合成为使特异性融合成为可能可能。但由于电脉冲的特异性电脉冲的特异性，因此，特异性特异性只能发生在只能发生在细胞聚集时

5、细胞聚集时，使这种特异造成的膜的膜的可逆击穿可逆击穿不具有不具有选择性选择性，特异性受到特异性受到很大的很大的约束约束，且电融法易造易造成成细胞损伤细胞损伤，影响合成细胞的融合。以往方法的缺点w 因此，激光细胞融合法应运而生，它避免了上述两种方法的缺点。激光细胞融合法（定义）激光细胞融合技术是采用高峰值密度激光细胞融合技术是采用高峰值密度的激光对两细胞接触处的质膜进行辐照，的激光对两细胞接触处的质膜进行辐照，质膜发生光击穿，可产生微米数量级的微质膜发生光击穿，可产生微米数量级的微孔。孔。由于质膜的微孔是可逆的，质膜分子由于质膜的微孔是可逆的，质膜分子在重组过程中借助细胞连接表面的高张力在重组过

6、程中借助细胞连接表面的高张力（小孔表面的曲率很大），细胞逐渐从哑（小孔表面的曲率很大），细胞逐渐从哑铃壮变为圆球状，两个细胞就融合了。铃壮变为圆球状，两个细胞就融合了。2.发展历史w 早在1838年Muller在肿瘤组织切片中就观察到细胞融合的现象，以后陆续有人报道。但从18381958这一时期，人们只对这种自然存在的细胞融合现象进行描述和推测描述和推测。发展历史w 自从1958年冈田善雄在偶然的机会中发现了仙台病毒能诱导小鼠腹腔艾氏腹水癌细胞融合，继而做了一系列工作，因而为体外诱导细胞融合打下方法学基础。发展历史w 1965年 Harris Watkin在此基础上利用紫外线灭活的仙台病毒诱导

7、不同种动物的细胞融合成功，并证明这种融合细胞能存活。同时Letterfield又利用二种具有不同酶缺陷的细胞融合，并用选择培养基成功地选出杂交细胞，因此细胞融合的试验性工作才开始蓬勃发展。发展历史w 1973年童第周教授把此技术引进我国，并利用大鼠瓦克肉瘤细胞与鸡红血球的杂交细胞，开展了肿瘤免疫实验。发展历史w 1987年联邦德国海得堡理化研究所首次报道用激光法诱导哺乳动物细胞融合和植物原生质融合。w 1990年我国张闻迪用激光微束诱导动物卵细胞融合成功。w 1992年卜宗式用激光微束诱导金盏菊原生质体融合，获初步成功 发展历史w 在短短的十几年里，细胞融合技术的发发展迅猛异常展迅猛异常，现在

8、不但可以用种内、种间、属间，甚至动植物细胞之间也可以融合。此外还可以用人工细胞进行融合，因而为细胞重组细胞重组和细胞工程细胞工程开劈了广阔的研究领域。3.讨论与分析讨论与分析3.1 定义定义w 细胞融合实际上是以某种手段某种手段改变两个细胞接触处质膜接触处质膜的通透性通透性，使两个细胞的内含物相互混合而成为一个细胞的过程。w 激光细胞融合就是利用激光微束对相邻相邻的细胞膜的细胞膜进行破坏（或扰动）破坏（或扰动）来诱导细胞融合。激光细胞融合w 激光细胞融合技术是采用高峰值密度高峰值密度的激光对两细胞接触处的质膜接触处的质膜进行辐照，质膜发生光击穿，可产生微米数量级微米数量级的微孔。由于质膜的微孔

9、是可逆的质膜的微孔是可逆的，质膜分子在重组过程中借助细胞连接表面的表面的高张力高张力（小孔表面的曲率很大），细胞逐渐从哑铃壮变为圆球状，两个细胞就融合了。激光细胞融合w 将激光光束通过光学系统加以聚焦聚焦，形成非常细非常细的光束，称为激光微束激光微束。激光微束的光斑直径光斑直径小至几微米几微米或1 1微米以微米以下下。在理论上，光斑直径光斑直径可以小到波长波长的一半的一半。3.2微束激光细胞融合两个主要问题微束激光细胞融合两个主要问题:3.2.1激光照射的最佳条件确定最佳条件确定问题，如激光波长、单脉冲能量和脉冲个数的选择问题。3.2.2细胞质膜的光击穿光击穿问题。即如何得到可自行愈合的所谓“

10、可逆性可逆性”微孔，细胞膜穿孔机制的研究等问题。波长的选择问题w 由于不同生物细胞、质膜的脂质数量和脂类的组成虽有较大的差异，但其基本基本组成组成与人的红血细胞人的红血细胞的脂质脂质相同相同。从人的红血细胞膜及其脂质的吸收光谱，如图2-1和图2-2示。波长的选择问题波长的选择问题w 可以看出激光波长在300nm-900nm 300nm-900nm 范围内，红血细胞膜及其膜质无明显吸无明显吸收峰收峰。远紫外光远紫外光对细胞有较强的致死较强的致死作用，故不采用不采用。w 所以可采用300nm-900nm300nm-900nm的激光照射细胞，据实验的具体要求对波长进行选择。单脉冲能量和照射激光脉冲数

11、与细胞融合的关系w 为了确定单脉冲能量单脉冲能量和照射激光脉冲数激光脉冲数与细胞融合的关系，佐藤俊一采用波长为355nm355nm,脉宽为17ns17ns，脉冲重复频率为100HZ100HZ的染料激光器。以鼠骨髓瘤细鼠骨髓瘤细胞胞为材料，作了研究,其结果如下两图示。由图2-3可知，脉冲能量达1.5uJ1.5uJ时，融合率融合率上升到约50%50%，但超过此能量时反而降低，因为单脉冲能量过高能量过高时，照射激光的细胞对被分离破坏分离破坏的增多，导致融合率融合率下降下降。w 由图2-4可知，当脉冲为3030个时，融合率最高融合率最高。但如在融合后融合后继续照射，会使细胞损伤、被破细胞损伤、被破坏坏

12、，导致融合率下降融合率下降，所以对于鼠骨髓瘤细胞融合的最佳单脉冲能量最佳单脉冲能量和照射脉冲个数照射脉冲个数是1.5uJ1.5uJ和3030个脉冲。3.2.2细胞质膜的光击穿问题细胞质膜的光击穿问题w 据现代理论:细胞膜多采用液体镶嵌液体镶嵌(fluid mosaic model)模型，这是个动动态模型态模型，认为细胞膜是由脂质双分子层中镶嵌镶嵌着球蛋白质分子，按二维二维排列的液状体组成的。膜的双分子层双分子层具有流动流动性性，蛋白质分子在膜中的分布是不对称不对称的。它的模型如下图示。3.2.2细胞质膜的光击穿问题细胞质膜的光击穿问题w 关于细胞膜的击穿细胞膜的击穿问题，有人认为激光脉冲作用时

13、间短、热效应小、冲击效应大,这时膜孔可闭合。w 有的学者则认为激光微束照射在细胞壁上，光压效应小，不足以使细胞壁穿孔；产生穿孔是一种热效应热效应。细胞质膜的光击穿问题w 膜吸收光子产生热效应，这种热效应不会造成照射点周围的热损伤。如激光脉宽为5ns5ns，时间短、热量未能及时扩散未能及时扩散到周围环境，照射点温度由 升到 ,最后到达 ，然后温度逐渐地由 降低到 、0T1T2T2T3T4T5T3.2.2细胞质膜的光击穿问题细胞质膜的光击穿问题w 可见激光微束不会在照射点周围引起 热损伤。w 仍能保持细胞的正常生理、生化特性，w 不影响细胞的存活 如何得到“可逆性可逆性”微孔w 激光作用于细胞膜上

14、，产生可逆性微孔，到底是热效应为主，还是光压效应为主？w 针对这一问题，沈子威教授又利用扫描扫描电子显微镜电子显微镜(SEM)(SEM)进一步研究了激光微束作用于细胞膜上产生可恢复性小孔可恢复性小孔的形成机理，认为膜的变化主要是由光压光压造成的。如何得到“可逆性可逆性”微孔w 实验发现：对不同生物不同生物的细胞膜，所需穿孔的激光微束能量不同激光微束能量不同，与膜种类、厚度、膜膜种类、厚度、膜的弹性强度的弹性强度有关。w 一般植物植物细胞所需能量比动物动物细胞要大大。w 对动物卵细胞卵细胞(如蛙卵、鱼卵等)，因卵膜厚且富有弹性，实验中要用很强的激光束能量刁能穿孔。能量不够强，则只能使卵膜产生局部

15、凹陷局部凹陷，而不能击穿不能击穿。这说明激光微束产生的光压效应光压效应确实对细胞膜上产生可逆性穿可逆性穿孔孔起主要作用。如何得到“可逆性可逆性”微孔w 对这种光压造成的可恢复性“小孔”，从分分子模型子模型上分析，是由于光压作用光压作用给磷脂层磷脂层一个冲击力，将其在某处断开断开，断开瞬间，脂膜流动性流动性使磷脂分子在冲击处向两侧挤靠两侧挤靠，从而使孔边缘处孔边缘处磷脂侧向排列趋向紧密排列趋向紧密，由于脂质的两性特性，它重新排列如图2-7所示。w 这时膜处于“亚稳态”。从上方俯视膜孔，如图2-8所示。如何得到“可逆性可逆性”微孔如何得到“可逆性可逆性”微孔w 此时激光脉冲过后，膜仍具有一定的流动

16、性，磷脂分子会逐渐恢复恢复到天然膜的原始状态一恒稳态。激光微束在细胞膜上产生的可逆性小孔可逆性小孔，是微米量级微米量级的，如微孔孔洞过大微孔孔洞过大，则它不再是可逆性的了，说明它对细胞造成了永久性损伤永久性损伤。如何得到“可逆性可逆性”微孔w 综上所述，如是产生了可逆性小孔可逆性小孔，则主要是由光压光压造成的，由热效应热效应产生的膜击穿膜击穿，一般是不可逆不可逆的，当然如光压光压过大过大，造成孔洞过大孔洞过大，则孔洞也是不可不可逆逆的。如何得到“可逆性可逆性”微孔w 如用激光照射在两接触的接触的细胞膜，在两细胞膜上均产生了可逆性可逆性的，微米量级微米量级的微孔，那这时两细胞膜将如何发展呢?w

17、这时质膜分子在重组过程中，由于范德范德瓦尔斯力瓦尔斯力作用而聚集排列、形成分子连分子连接桥接桥，细胞连接处膜的表面曲率很高，张力大，细胞就逐渐由哑铃状哑铃状变为圆球圆球状状，细胞融合起来。如何得到“可逆性可逆性”微孔w 另外，由于脂质的两性特性两性特性，即它具有亲水亲水性头基性头基以及厌水性的尾端厌水性的尾端 通常是脂肪酸链。所以细胞膜的脂质双层具有细胞膜的脂质双层具有自行组合自行组合，自行修补自行修补的功能。这就是微束激光诱导的功能。这就是微束激光诱导细胞细胞融合的机理融合的机理。w 微束激光细胞融合实际上是利用微束激光改微束激光细胞融合实际上是利用微束激光改变两个细胞变两个细胞接触处接触处

18、细胞膜细胞膜的的通透性通透性，使两个，使两个细胞的内含物混合成一个细胞的过程。细胞的内含物混合成一个细胞的过程。如何得到“可逆性可逆性”微孔如何得到“可逆性可逆性”微孔如何得到“可逆性可逆性”微孔4.激光细胞融合的特点激光细胞融合的特点 易于实现特异性细胞融合。定时定时、定位定位性强,可选择任意两个细胞，可非接触，安全，远距离操作，可实时观察。是一种无毒无毒的，损伤很小损伤很小的，甚至可实现无损伤无损伤的融合方法。实现了装置化装置化，智能化智能化操作方便4.激光细胞融合的特点激光细胞融合的特点实验参数易于控制参数易于控制，重复性较好重复性较好，融合融合机理较清楚机理较清楚，便于开展定量研究定量

19、研究 而其他方法存在重复性差、经验性大、重复性差、经验性大、影响因素多、融合率不稳定、融合机理影响因素多、融合率不稳定、融合机理不清楚不清楚等问题。缺点：只能逐一逐一处理细胞，不能象其他方法一样同时处理大量细胞。另外它的设备相对昂贵些。5.应用应用动物体细胞杂交技术主要应用动物体细胞杂交技术主要应用w 基因定位和绘制人类基因图谱人类基因图谱w 生产树突状细胞抗肿瘤疫苗抗肿瘤疫苗w 生产单克隆单克隆抗体w 动物育种动物育种w 细胞疗法细胞疗法单克隆抗体备置在基础理论研究方面的应用在基础理论研究方面的应用w 研究细胞的核质关系核质关系和个体发育个体发育 w 揭示疾病发生疾病发生的机制w 膜蛋白动力

20、学膜蛋白动力学研究植物细胞融合技术 w 通过植物细胞融合培育抗病新材料抗病新材料；w 合成新的物种新的物种；w 转移转移细胞质基因基因。植物细胞融合技术 w 植物细胞融合技术目前主要是作为扩大扩大变异变异的手段，同时也正朝着将抗药性抗药性和胞质雄性不育雄性不育等细胞质基因导入另一个体细胞的方向发展，有可能形成新的核核质杂种质杂种。植物细胞融合技术w 在生产应用方面，植物细胞融合在育种育种上有重要的应用价值，通过诱导不同种同种间、属间间、属间甚至不同科间科间原生质体的融合，可能打破有性杂交不亲和性有性杂交不亲和性的界限，广泛组合各种基因型，从而有可能形成有性杂交方法所无法获得的新型杂种植物新型杂

21、种植物。w 细胞融合抗盐碱耐干旱水稻新品种w 细胞融合抗盐碱耐干旱小麦新品种植物细胞融合技术w 国内已经育成多个耐盐小麦品种，但产量低或易倒伏和感染病害。该小麦品种该小麦品种是针对是针对耐盐小麦育种耐盐小麦育种需要解决的问题而需要解决的问题而选育的选育的大穗、多穗型小麦新品种大穗、多穗型小麦新品种。该品种在产量、稳定性、抗盐性、品质等方面均优于现有的耐盐品种。微生物细胞融合技术w 对微生物而言，该技术主要用于改良改良微生物菌种特性特性、提高提高目的产物的产量产量、使菌种获得新的性状新的性状、合成新产物新产物等。w 与基因工程基因工程技术相结合，使对遗传物质进一步修饰提供了各种各样的可能性。微生物细胞融合技术w 微生物细胞融合技术的一项突出应用是生物药品生物药品的生产，包括抗生素、生物活性物质、疫苗等，它适用于疾病的诊断、预防及治疗等。另一方面的突出应用就是为发酵工业提供优良菌种。微生物细胞融合技术w 目前，微生物细胞融合的对象已扩展到酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间，不断培育出用于各种领域的新菌种新菌种。