免疫胶体金技术课件

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1、免疫胶体金技术1免疫胶体金技术Immune colloidal gold technique 免疫胶体金技术2胶体金标记技术的相关定义l免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗 体的一种新型的免疫标记技术。l胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。免疫胶体金技术3胶体金技术的发展Development of Immune colloidal gold technique 1939-雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。1971-作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗

2、粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。1974-实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法免疫胶体金技术4胶体金技术的种类及优点l快速免疫金渗滤法快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay,IGFA)(immuogold filtration assay,IGFA)即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。免疫胶体金技术5 免疫胶

3、体金技术6免疫胶体金技术的特点优点：检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；试剂稳定，适用于单份测定；无污染。GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。免疫胶体金技术7 最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其精密度和准确性均符合定量测定要求。不足：金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一

4、性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开发与应用。免疫胶体金技术8Colloidal Gold Synthesis Solution color varies extensively with particle sizeUsually a deep red,but also dark brown/purple to light orange/yellow Colloid size can be controlled by Au:Citrate ratiosAnywhere between 1nm-100nm+Citrate is easily

5、substituted by other more Au-philic molecules(i.e thiols)H2O,100OCH2AuCl4Cit-Cit-Cit-Cit-Turkevich,et.al.Discussions Faraday Soc.1951,No.11 55-75.OOOOHOOO免疫胶体金技术9免疫胶体金技术10Procedure of Colloidal Gold SynthesisAdd 100 mL of 1.0%HAuCl4 to a 200 mL Erlenmeyer flask on a stirring hot plate.Add a magnetic

6、 stir bar and bring the solution to a boil To the boiling solution,add 1.5 mL of a 1%solution of trisodium citrate dihydrate,Na3C6H5O7.2H2O Stop heating when a deep red color is obtained.免疫胶体金技术11Synthesis and properties of different particle size 免疫胶体金技术12TEM Images of Colloidal AuGood gold colloid

7、s and bad(unstable)gold colloids.劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大 免疫胶体金技术13How are the antibodies coupled to the gold?Conjugation of antibodies to gold particles depends upon three separate but dependent phenomena:a).ionic attraction between the negatively charged gold and the positively charged protei

8、n b).hydrophobic attraction between the antibody and the gold surface c).Sulfur binding(Cysteine and Methionine)Strongest binding suggested to be the sulfur hinge joining the the two Fc regions免疫胶体金技术14胶体金颗粒带电情况 抗体和金颗粒的耦联（图出处：IVD Technology）免疫胶体金技术15SAMPLE GOLD CONJUGATION PROTOCOL Adjust the gold c

9、olloid to the proper pH;Determined the minimum amount of protein;Final conjugation PurificationPurification 免疫胶体金技术16Adjust the gold colloid to the proper pH 胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液

10、的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可.免疫胶体金技术17蛋白 与胶体金结合的最佳pH测定 取若干1.5ml的试管，分别加入1ml胶体金 用K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；去96孔培养板，按pH从高到低分别将上述胶体金分别取100ul加入孔中，重复三次；每孔分别加入20ul浓度为10%的NaCl溶液，混合，室温下放置10min；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH免疫胶体金技术18Adjust the gold colloid to the proper pH常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值免疫胶体金技术19Determi

11、ned the minimum amount of protein（1）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml 10%NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图5.2中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45g/ml。免疫胶体金技术20（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由5g45g另设对照管），各取等体积顺序加

12、入一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表5-5顺序进行。免疫胶体金技术21 1.Pipette 1ml of colloid into each of a series of 3ml clean plastic tubes.2.Adjust the antibody(0.1ug/ul)to the proper pH with 100nM K2CO3 or 100mM HC1.3.Add the antibody to each tube in a series from 0-150ul(ie 0-15ug in steps of 0,1

13、,2,3.15ug).4.Shake each tube and leave for approximately 5 minutes to conjugate.6.To each tube add 100ul of 10%NaC1 and agitate for 1 minute.7.The Tube containing the minimum amount of protein required to stabilize the gold sol is indicated by the one in which the color of the gold sol does not chan

14、ge from red to blue upon the addition of NaCl.免疫胶体金技术22Final conjugation(IgG)lTake 100ml of gold sol and adjust to Ph9lAdjust the dialyzed and centrifuged antibody solution(0.1ug/ul)to pH9.2l Add the determined amount of antibody solution dropwise to the gold while stirring rapidlylAfter 5 minutes a

15、dd 10ml of filtered 10%BSA at pH9 and stir gently for 10 minutes.免疫胶体金技术23Purification The gold conjugate must be purified from excess antibody and any small clusters removed before concentrating and storing.l Spin the gold conjugate at speeds according to gold particle size.lThe gold conjugate will

16、 form a loose precipitate at the bottom of the tube.Discard the clear supernatant and resuspend the pellet with proper buffer.免疫胶体金技术24胶体金免疫层析法试剂的组成免疫胶体金技术25u样品垫(Sample pad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。样品垫的作用：减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布；去除样品中杂质颗粒；调节样品液pH值或粘度等。样本垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差异，提高试验的灵敏度。通常可

17、以将洗涤剂、粘性增强剂、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使用复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。免疫胶体金技术26u结合垫(Conjugate pad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。结合垫的作用主要为：-吸附一定量的金标结合物颗粒；-吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上；-保持金标结合物颗粒的稳定性；-保证金标结合物颗粒定量完全释放等。免疫胶体金技术27u硝酸纤维素膜(Nitrocellulose)：推荐使用Millipore，MDI，S&S，whatman 等国外公司的硝酸纤维素膜。NC膜的作用：-在检测线和对照线条带区域固定抗

18、体；-样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应；-反应在NC膜上显色，读检测结果 NC膜的重要参数：孔径、对称性、层析速度、表面活性剂、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均一性等。免疫胶体金技术28免疫胶体金技术29硝酸纤维膜的选择u膜的分类标准膜的分类标准(m(m和和s)s)m:指的是膜孔径，s:以秒为单位的定义为，每4cm膜，水的层析时间是*s.换算情况大致为：8um=135s；6um=180s u不同秒数的膜对反应的影响不同秒数的膜对反应的影响 通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反

19、应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。135s135s一般用在双抗体夹心法，一般用在双抗体夹心法，180s180s一般用在竞争法一般用在竞争法.免疫胶体金技术30u如何选择物理性能物理性能 膜的物理性能主要是2个参数，膜厚度和宽度 厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能，点出来的C/T线宽窄不一，另外也影响爬速；宽度(检测区的长度)和爬速及灵敏度的关系跑水性能跑水性能 注入足够溶液到槽内，将不同批次膜每隔1cm做一次标记（总长大于4cm）并放到倾斜支架，整个支架下端放入溶液槽，膜开始吸液，计时。记录每个标记处的通过时刻，并与对照组比较。跑板

20、时，理论上溶液呈水平线形式上吸，观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。点样测试点样测试 C/T线出线时间和灵敏度 免疫胶体金技术31u片材：不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了产品的货架期。u吸收垫(Absorbent Pad)：提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸收纸；吸收纸的作用：主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。免疫胶体金技术32研究和应用胶体金法检测胶体金法检测TB-Ab(双抗原夹心法双抗原夹心法)免疫胶体金技术33THANKS AND BLESSING免疫胶体金技术34此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！