质粒的提取及其酶切

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1、实验二：质粒（pEGFP-N1）的提取一. 实验目的 了解碱裂解法提取质粒的基本原理和主要应用，掌握碱裂解法提取质粒的实验方法和各种试剂在提取过程中的作用。二. 实验原理碱裂解法是利用细菌染色体DNA与质粒DNA结构的大小差异来分离质粒DNA的。碱性（pH 12.012.5）条件可以破坏碱 基配对，宿主和质粒DNA的碱基之间的氢键被破坏。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），共价闭合环状的质粒DNA 会迅速准确地恢复配对，重新形成完全天然的超螺旋分子；而较大的细菌染色体DNA分子则难以复性，会交联形成不溶 于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，

2、用异丙醇沉淀、70 % 乙醇洗涤即可获得质粒DNA。三. 仪器设备微量取液器（2 p L； 20 p L； 200 p L； 1 000 p L）, tip头，手掌型离心机，1.5 mL离心管，恒温水浴，制冰机， 超净工作台，恒温培养箱。振荡器，离心机，金属浴，电泳仪，凝胶成像仪。四实验试剂1. 溶液 I： 50 mmol/L 葡萄糖；20 mmol/L TrisHCl（pH = 8.0）； 10 mmol/L EDTA （pH=8.0），高压蒸汽灭菌（121 C， 0.105 Mpa） 20 min4 C贮存。2溶液11（现用现配）：0.2 mol/L NaOH； 1 g / L SDS。3

3、. 溶液 111（pH 4.8）:每 100 mL 溶液中含 5 mol/L 乙酸钾 60 mL；冰乙酸 11.5 mL； H2O 28.5 mL。4. RNase （10 mg / mL），LB液体培养基，氨苄青霉素，异丙醇，70 % （V / V）乙醇，无菌水。 五.实验步骤：1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于3-5mlLB （含氨苄）液体培养基中，37C振荡培养12-14小时。2、取上述培养物移入1.5mlep管中，室温以8000r/min离心5分钟，弃上清，再加1.5ml上述培养养物于ep管中，室 温以8000r/min再离心5分钟。3、弃上清液，将离心管倒置，使液体尽可能流

4、尽。4、加溶液I 100p l,用力弹ep管，使菌体分散均匀；加溶液Il200p l,颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心ep 管放置于冰上5分钟，使细胞膜裂解（溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。5、 加入150p l预冷的溶液III，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置10分钟。（溶液III为中和溶 液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。）然后， 室温以12000r/min离心5分钟。6、抽取上清液于一新微量离心管（ep管）中，加无水乙醇900p l,冰浴20分钟，室温以13000r/min离心10分钟

5、， 放入净化工作台用风机吹干，加TE,定容至30p l,再加RNA酶5p l，37C水浴30分钟。（-20C保存备用）实验三：质粒的酶切一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。二、实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中 向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于DNA分子本身的大小和构型。溴乙锭是一种荧光染料， 这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，它与DNA的结合几乎没有碱基序列的特异性。在高离子强度的饱和溶 液中，大约每2.5个碱基插于一个溴乙锭分子。与DNA结合的

6、染料在紫外线下呈现橙色荧光。三、实验设备1主要仪器（1）1.5mL塑料离心管和tip头（2）微量加样器10p L、100p L、1 000p L各一支（ 3）台式高速离心机（20 000r/min）（4）水浴锅、微波炉，50ml三角瓶（ 5）电泳仪，电泳槽2材料PEGFP-N1（330bp）3. 实验试剂1琼脂糖，lXTAE（Tris-乙酸 0.04M, EDTA 0.001M, pH 值为& 2）2.1mg/ml溴乙锭（终浓度为0.5|j g/ml, EB见光易分解，棕色试剂瓶中于4C条件下保存）3. 上样缓冲液（增加样品的密度保证样品沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程，能明确显现

7、样品在电泳胶上泳动位置，溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的迁移速率是二甲苯氰迁移速率的2.2倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。）4. 电泳缓冲液 50XTAE：（242 gTris, 57.1 ml 冰醋酸，100ml 0.5 M EDTA （pH8.0）四、实验步骤1、制胶：1%琼脂糖电泳：琼脂糖0.5克，TBE50毫升放电炉上使之融化，温度降到50摄氏度时加入EB冷凝后倒胶，30分钟后凝固，拔去梳子。2、加样：取已转化的感受态细胞溶液10微升，再加5微升上样液。3、电泳：电压40V和电流50mA条件下，50分钟后用紫外灯观察（有无条带），若有条带跑出，进行抽提。1）加TE400微升、酚/氯仿/异戊醇（25

8、:24:1） 400微升，用力弹匀。室温下，12500rpm离心10分钟。观察到液体分 三层，取上层液于一新灭菌过的EP管中，再加氯仿400微升，然后室温下，12500rpm离心10分钟。2）取上清液，加无水乙醇9001000微升、乙酸铵100微升，用力震荡。 -20摄氏度下放置1-1.5小时，然后室温下，13000rpm 离心 5-10 分钟。3）弃去上清液，加75%的酒精混匀。室温下，12500rpm离心5分钟。4）弃去上清，把EP管放入净化工作台用风机吹干后，用TE定容至30微升。4、酶切： 30微升体系取上述液体15微升，加多组分缓冲液3 微升BSA3 微升灭菌超纯水7 微升HINDIII 和 BamHI各1微升以上操作皆在冰上，操作完后37摄氏度水浴34小时。五、实验结果：参考实验教材，用铅笔绘制带上marker电泳图。（质粒被切成两个条带分别是700bp和100bp。这个条带我不知道你们见过没，画的时候大的条带在下面，因为跑的时候迁移的速率较慢，小的条带在上面，电泳 的时候迁移的速率较快。）