霍乱弧菌实验室检验技术

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1、2023-1-7霍乱霍乱实验室检测技术淄博市疾病预防控制中心卫生检验中心 李玲2023-1-7内容内容一、霍乱概述二、霍乱病原学三、霍乱弧菌常规检验四、霍乱弧菌的快速诊断五、霍乱弧菌的噬菌体-生物分型六、霍乱菌株的管理、保存与上送2023-1-7一、霍乱概述霍乱概述霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌（Vcholerae）引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波及范围广、危害严重的甲类传染病。是国内交通检疫传染病之一。也是当今三种国际检疫传染病中最严重的一种。2023-1-71883年德国科学家Koch发现霍乱弧菌1905年埃及埃儿托检疫站首次分离到ElTor弧菌，与霍乱弧菌甚为相似，但经过

2、多年的观察并不致病或仅引起轻度腹泻，直到1937-1958年发生4次爆发后才逐渐认识到ElTor弧菌致病性1992年10月印度马德拉斯发现了新菌型O139霍乱弧菌2023-1-7霍乱的病原学分类霍乱的病原学特征2023-1-7霍乱弧菌抗原结构及分类抗原结构 霍乱弧菌有耐热的菌体（O）抗原和不耐热的鞭毛（H）抗原。H抗原为霍乱弧菌属所共有；O抗原有群特异性和型特异性两种抗原，是霍乱弧菌分群和分型的基础。WHO腹泻控制中心将霍乱弧菌分为三群。01群霍乱弧菌：包括古典生物型霍乱弧菌（vibrio cholerde）和埃尔托生物型（vibrio cholerde EL-Tor biotype）。01群

3、的特异抗原有A、B、C三种，其中A抗原为01群所共有，A抗原与其他B与C抗原结合则可分为三型，即：原型AC（稻叶，Inaba）、异型AB（小川，Ogawa）和中间型ABC（彦岛，Hikojima）。2023-1-7 非01群霍乱弧菌：本群弧菌鞭毛抗原与01群相同，而菌体（0）抗原则不同，不被01群霍乱弧菌多价血清所凝集，依O抗原之异，本群可分为137个血清型。以往认为本群仅引起散发的胃肠炎性腹泻，一般此类弧菌感染不作霍乱处理，但1992年在印度及孟加拉等地发生霍乱暴发流行，后证实流行菌不被01群和137个非01群霍乱弧菌诊断血清所凝集。乃定为0139霍乱弧菌，并认定为真正的霍乱弧菌。不典型01

4、群霍乱弧菌：可被多价01群血清所凝集，但该群菌不产生肠毒素，因此无此病性2023-1-7霍乱病原体分类 古典生物型古典生物型 小川型小川型 O1群群 稻叶型稻叶型 埃尔托生物型埃尔托生物型 颜岛型颜岛型霍乱弧菌霍乱弧菌 霍乱病原菌霍乱病原菌 O139群（群（Bengal）非非O1群群 O2-O200群群 腹泻病原菌腹泻病原菌2023-1-7O1群和O139群抗原构造与血清分型群特异性抗原型特异性抗原AO139BC小川+少量少量稻叶+彦岛+O139 +2023-1-7霍乱病原学特点形态与染色弧状或逗点状革兰染色阴性有一根单鞭毛，细菌运动非常活泼，呈鱼群穿梭样或流星状2023-1-7革兰染色202

5、3-1-7电镜负染色鞭毛2023-1-7O139群和O1群霍乱弧菌特性对比 近年来，O139群霍乱弧菌已成为霍乱流行的主要病原。通过研究证明，O139群霍乱弧菌可能是O1群EItor 生物型的变异株。(1)抗原构造 (2)分泌肠毒素 (3)耐药性 (4)临床特点2023-1-7 抗原构造uO139群霍乱弧菌不被已知的O1-O138群霍乱弧菌诊断血清所汇集。表明本菌的抗原性与O1群和其它非O1群霍乱弧菌有明显区别。革兰氏阴性菌的抗原性都是由细胞壁的脂多糖（LPS）所决定。通过对O139群霍乱弧菌的LPS进行化学分析和血清学分析后发现O139群霍乱弧菌缺少O1群霍乱弧菌LPS中的特异性成分。通过两

6、者进行提取其LPS然后进行被动溶血试验与被动溶血抑制试验检测，结果显示两者抗原性有显著不同。O139群霍乱弧菌有荚膜而O1群霍乱弧菌无荚膜。2023-1-7两者不同点：u O139O139群所致病中有群所致病中有44.3%44.3%可发生腹部痉可发生腹部痉挛，也有引起严重粘液性腹泻的，进入挛，也有引起严重粘液性腹泻的，进入外周血液可引起发热，出现菌血症或败外周血液可引起发热，出现菌血症或败血症。印度出现血症。印度出现2020例病人中有例病人中有1717例发热、例发热、白细胞增多。而白细胞增多。而O1O1群引起的病人未曾见群引起的病人未曾见过。过。u鉴别两者，必须通过鉴别两者，必须通过血清学诊断

7、血清学诊断来区分。来区分。uO22O22群与群与O139O139群血清有交叉汇集反应，必群血清有交叉汇集反应，必须用须用O22O22群弧菌吸收，去除交叉汇集现象群弧菌吸收，去除交叉汇集现象。2023-1-7 总之，总之，O139O139群霍乱弧菌和群霍乱弧菌和O1O1群弧菌二群弧菌二者生物型既有区别又有联系。最大区别者生物型既有区别又有联系。最大区别是荚膜和是荚膜和O1O1群生物合成基因的有无这些群生物合成基因的有无这些提示，提示，O139O139群霍乱弧菌不是群霍乱弧菌不是O1O1群群EItorEItor生生物型简单的点突变。可能存在更复杂的物型简单的点突变。可能存在更复杂的突变机制。突变机

8、制。二者是否只有个别基因和表型的差异二者是否只有个别基因和表型的差异以及是什麽原因导致了这些差异（尤其以及是什麽原因导致了这些差异（尤其是是O139O139群表面荚膜的出现）还有待于进群表面荚膜的出现）还有待于进一步的研究。一步的研究。2023-1-7样本采集、送检和保存样本采集、送检和保存 2023-1-7样本采集、送检和保存样本采集、送检和保存 粪便：粪便：标本的采集以病人粪便为主，水样便采取13mL，成形便采取指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内35cm处采取。急性期病人取水样便标本在增菌培养的同时可取其粘液絮片或用棉拭子直接接种于碱性琼脂、TCBS琼脂培养基。带菌者粪

9、便都应接种碱性蛋白胨水培养基，放37增菌68h后，从菌膜下表层取一接种环培养物，划线接种于碱性琼脂、TCBS琼脂培养基。不能立即检查的，要放入碱性蛋白胨水或文腊二氏保存液或插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基中。标本与保存液比例约为1 5。2023-1-7水样：水样：十倍浓缩碱胨水增菌培养法：十倍浓缩碱胨水增菌培养法：水体的采集一般用无菌的500ml水样瓶采集相对静止的表层水(深度为30cm以内)500ml。非疫情状态下的监测时间一般在清晨，此时水体未受人群活动等因素影响。每个采样点中采样位置应相距数米、采集2瓶做为平行检测，3小时内送检。取450ml水样，用1M 氢氧化钠调整至pH

10、8.4-9.2，ml。然后加10倍浓缩碱性胨水50ml。再加入1%亚碲酸钾0.250.5 ml和1000单位/ml青霉素1 ml。37培养过夜，取菌膜下表层培养物接种4号培养基分离培养同时吸0.20.5 ml转种于10ml碱性胨水管中作二次增菌，37培养68h再划线接种于碱性琼脂、TCBS琼脂培养基进行分离。2023-1-7食品及水产品样本食品及水产品样本：涂抹采集：涂抹采集：使用无菌棉签涂抹5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。37培养过夜，取菌膜下表层培养物接种4号培养基分离培养同时吸0.20.5 ml转种于10ml碱性胨水管中作二次增菌，37

11、培养68h再划线接种于碱性琼脂、TCBS琼脂培养基进行分离。整体或局部采集整体或局部采集：在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠内容物25克剪碎后，置灭菌均质杯或均质袋中，加入225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入三角瓶中增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外壳等)整体放入三角瓶进行增菌处理。37培养68h再划线接种于碱性琼脂、TCBS琼脂培养基进行分离。2023-1-7培养培养直接分离培养直接分离培养 急性期病人水样大便标本在增菌培养的同时可取其粘液絮片或用棉拭子直接接种在选择性培养基上。目前常用的强选择性培养基有TCBS

12、琼脂、碱性琼脂、庆大霉素琼脂和4号琼脂等。霍乱弧菌在TCBS上因分解蔗糖呈黄色菌落,此是 WHO推荐使用培养基。2023-1-7增菌增菌/二次增菌分离培养二次增菌分离培养 所有粪便标本都应接种碱性蛋白胨水培养基，放37增菌68h后，从菌膜下表层取一接种环培养物，划线接种于强选择性碱性琼脂和TCBS琼脂平板各两个。必要时进行二次二次增菌增菌2023-1-7疑似菌落初步鉴定：每个碱性琼脂、TCBS琼脂平板上各挑取5个以上(少于5个的全部挑取)疑似菌落接种于营养琼脂平板/营养琼脂斜面或克氏双糖置3718-24h纯培养(即每份样品至少从2个分离平板上获得约10株可疑菌落菌株)，取斜面纯培养物进行血清鉴

13、定、并涂片进行革兰氏染色及氧化酶试验等。挑取可疑菌落作玻片凝集 与O1群多价和单价血清作玻片凝集反应 与O139群抗血清做凝集反应 2023-1-7血清鉴定：自分离培养基上挑取可疑菌落与01群霍乱弧菌多价/单价诊断血清及0139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。玻片凝集用血清的效价一般应为1 401 50。如可疑菌落在血清中很快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落逐个进行玻片凝集检查，必要时，取原划线菌落边缘透明部分再做玻片凝集，均为阴性时方可报告未检出01群及0139群霍乱弧菌。对首发病例菌株需送上一级实验室做进一步鉴定

14、或复查。2023-1-7霍乱是烈性传染病，对首例病人的病原学诊断应做到快速、准确，并及时作出检测报告提高分离平板技能技能：考核最低要求9cm平板划线分离，至少要保障有50个以上单个菌落为及格，但菌落过于密集仍为技能不良的表现。严禁9cm平板分离2份以上样品。2023-1-7强调在选择培养上发现疑似菌后，首先强调在选择培养上发现疑似菌后，首先考虑进行考虑进行01/0139群霍乱弧菌的玻片凝集群霍乱弧菌的玻片凝集试验。必须从平板上各挑取试验。必须从平板上各挑取5个以上的个以上的（少于（少于5个的全部挑取）疑似菌落进行个的全部挑取）疑似菌落进行01/0139群霍乱弧菌玻片凝集试验。群霍乱弧菌玻片凝集

15、试验。不同类型的平板上，菌落形态有不同的不同类型的平板上，菌落形态有不同的特征特征-选择你最有把握的。选择你最有把握的。提高疑似菌落识别技能，注意观察积累提高疑似菌落识别技能，注意观察积累非典型状态的疑似菌落特征，这对你的非典型状态的疑似菌落特征，这对你的工作具有重要的帮助。工作具有重要的帮助。2023-1-7必须注意同一样品中必须注意同一样品中O1、O139群霍乱弧群霍乱弧菌可能同时存在，有必要对所有选出的菌可能同时存在，有必要对所有选出的菌落都进行凝集试验。菌落都进行凝集试验。提倡所选菌落先经纯培养后再作相关鉴提倡所选菌落先经纯培养后再作相关鉴定，除非情况特殊，一般不提倡直接使定，除非情况

16、特殊，一般不提倡直接使用疑似菌落作玻片凝集。尤其对于用疑似菌落作玻片凝集。尤其对于TCBS.如从分离培养基上直接挑取单个菌落进如从分离培养基上直接挑取单个菌落进行血清凝集试验，可能会有假阴性或假行血清凝集试验，可能会有假阴性或假阳性的出现，应谨慎判断结果，特别是阳性的出现，应谨慎判断结果，特别是外环境样品。外环境样品。2023-1-7早期玻片凝集法制动试验胶体金免疫层析快速检测 SPA协同凝集试验等方法免疫磁珠富集霍乱弧菌方法2023-1-7早期玻片凝集法早期玻片凝集法霍乱弧菌在碱性琼脂平皿上，37培养10h左右,在杂菌尚未未生长或生长很小的时，霍乱弧菌菌落可达1mm。此时将较大半透明菌落取出

17、，直接做玻片凝集实验，阳性者可初步报告，为开展疫情处理提供依据；待营养琼脂平板/营养琼脂斜面或克氏双糖置纯培养物生长良好后，再进行传统的鉴定以确认或订正报告。2023-1-7制动试验制动试验暗视野/相差显微镜直接镜检，水样便滴在玻片上，可见流星状动力的细菌；当加入01/0139免疫血清后，运动停止即凝集成块，根据这种特殊动力和制动试验，可提早做出初步诊断。注意：免疫血清使用浓度1：64，并尽可能不加防腐剂2023-1-7胶体金免疫层析快诊胶体金免疫层析快诊采用胶体金免疫层析双抗体夹心法，检测标本中霍乱弧菌。以胶体金作为标记物，交联抗霍乱弧菌单克隆抗体，与样品中的霍乱弧菌结合。形成双抗体夹心一步

18、法，呈现出目测可见的红色条带，显色程度与抗原含量成正比。2023-1-7免疫磁珠（免疫磁珠（IMS）富集霍乱弧菌）富集霍乱弧菌IMS分离病原菌可提高检测的灵敏度：O1群和O139群-IMB灵敏度可有效富集到数量级为101 CFU/ml的霍乱弧菌，其捕获率介于5%-63.04%之间，并且随菌液量的增加，IMB的捕获率也升高。IMS富集霍乱弧菌的灵敏度：干扰菌为102-5数量级的情况下，IMS检测结果比常规分离方法检测阳性的的干扰菌量高10倍。2023-1-7快诊断实验阳性者同时涂片染色和悬滴法观察，如镜检为革兰染色阴性弧菌或悬滴细菌呈“鱼群穿梭样”运动，氧氧化酶试验阳性化酶试验阳性，可作初诊报告

19、。为开展疫情处理提供依据；2、待营养琼脂平板/营养琼脂斜面或克氏双糖置纯培养物生长良好后，再进行传统的鉴定以确认或订正报告。2023-1-7、快诊断试验获得阴性结果，不能放弃分离培养，主张快速诊断试验仅用于主张快速诊断试验仅用于应急疫情处理应急疫情处理时，作为应急使用。2023-1-7五、霍乱弧菌系统鉴定和分型 血清分型-用普通琼脂或碱性琼脂培养基上的菌苔进行血清分型。用01/0139群及分型小川型及稻叶型的单价血清作玻片凝集反应系统生化特征-梅里埃20E及氧化酶试验粘丝试验等 噬菌体生物分型分子生物学等。2023-1-701群霍乱弧菌两个生物型的鉴别 鉴别试验 01群霍乱弧菌生物型 古典型

20、埃尔托型 第组霍乱噬菌体裂解试验 多粘菌素B敏感试验 /鸡血球凝集试验 /VP试验/溶血试验/2023-1-7噬菌体分型噬菌体分型 根据国内分离的五株弧菌噬菌体（VP1VP5）可将ElTor弧菌分成32个噬菌体型。其中16型为流行株，732型为非流行株；生物分型生物分型 根据菌株的溶原性、对溶原噬菌体的敏感性、山梨醇发酵试验和溶血试验可将El Tor霍乱弧菌分成12个生物型。其中af为流行株，gh为非流行株。2023-1-7埃尔托型霍乱弧菌噬菌体分型霍乱弧菌噬菌体型对 分 型 噬 菌 体 的 敏 感 性VP1VP2VP3VP4VP51+2+3+4+5+6+27+28+29+30+31+32.2

21、023-1-7埃尔托型霍乱弧菌生物分型生物型生 物 型 学 性 状溶原性对溶原性噬菌体敏感性山梨醇试验溶血试验a+-+b+-c-+-+d-+-e-+f-g+-+h+-+-i-+j-+-k-+l-+-2023-1-7噬菌体分型及其意义根据5株国内分离的弧菌噬菌体（VP1-VP5）将埃尔托型霍乱弧菌分成32个噬菌体型。1型菌株对5株噬菌体全敏感是最常见的流行株，但并非所有噬菌体1型菌株均为流行株。2型主要是1型的粗糙型，3-6型也属流行株范畴。7型以后属非流行株，对5株噬菌体全抵抗的是32型。非流行株仅引起散发病例，是一些疫区和非疫区自然水体中的主要菌型。2023-1-7O1群和O139群霍乱弧菌

22、的检验程序快速诊断增菌培养（碱胨水）分离培养TCBS、碱性琼脂（庆大霉素琼脂等）标本（粪便等）玻片凝集阳性（结合菌落、菌体形态）凝集菌落或可疑菌落纯培养（营养琼脂或克氏双糖培养）鉴定分型确诊报告第二次增菌（碱胨水）初步报告10-20小时6-8小时10-20小时直接2023-1-7六、霍乱菌株的管理、保存与上送基层对首发病例分离的霍乱菌株需送上一级实验室做进一步鉴定或复查。基层实验室送前应根据各自职责完成相应霍乱常规鉴定项目，主要包括：01/0139群霍乱诊断血清玻片凝集试验、革兰氏染色与形态、动力观查、氧化酶试验、粘丝试验、克氏双糖等。按要求,存放菌种的容器必须密封，容器防破损、防外泄。上送菌种应为营养琼脂 或克氏双糖斜面纯培养物。常温下保存送检,不主张冷(冻)藏送检霍乱菌种或样品.送交上一级疾控中心复核鉴定和分型前，应填写菌株上送登记表及送检单并及时与上送单位取得联系。2023-1-7谢谢！