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1、磷脂酰丝氨酸合酶(p)酶活测定方法1pss催化的转酯反应取1ml酶液进行反应，利用HPLC外标法测定产物磷脂酰丝氨 酸生成量，从而计算底物大豆卵磷脂的转化率。6h后，测定转酯反应 共生成的磷脂酰丝氨酸量。在本实验中，酶活反应在下述体系中进行反应:30ml的0.1mol/L 醋酸钠缓冲液(pH5.5)中含有0.15mol/L丝氨酸，同时加入1ml纯化 后的重组磷脂酰丝氨酸合成酶，与15ml含有0.75mmol卵磷脂的氯 仿行混合，在30C下200r/min混合得到均匀的乳状液进行反应。反 应6h后，停止转动，双液相静止分层。提取1ml有机相，经挥发后, 剩余物经氯仿洗涤两次，最后溶解于50p l
2、氯仿中,HPLC法分析产 物生成量。采用的流动相为乙腈：甲醇：85%磷酸=100: 10: 0.8,检测 波长206nm,样品进样量15p l,流速为1.0ml/min,利用外标法(以磷 脂酰丝氨酸标准品为外标物)计算底物卵磷脂的转化率。磷脂酰丝氨酸合成酶的酶活定义为:pH5.5、30C下，每小时转化 1p mol大豆卵磷脂所需要的酶量(mg)。2酶联比色法pss催化水解L-a-卵磷脂生成胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的作用下 生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化酶的作用下与牛氨基氨替比林和苯 酚生成醌亚胺显色物质，在A=500nm下具有吸光值。反应体系：将220mg的L-a-卵磷脂溶于含有3mL50mM的
3、SDS溶液、6mLlMNaOAc缓冲液(pH=8.0)、39mL的去离子水、0.272mL17.9%的乙醇溶液(终浓为1%)的混合体系作为底物溶解液。 将39mg4-氨基氨替比林、80mg苯酚及8mg过氧化酶溶于5.5mL的 100mM Tris HCl (pH=8)缓冲液中作为胆碱显色剂。取2.4mL底物溶 液、0.3mL的500mM CaCl2溶液、0.2mL的去离子水混合并置于35C 反应10min,沸水浴终止反应，待冷却至室温加入0.05mL 2M Tris HCl (pH=9)缓冲液，混合并离心后，上清用0.45m微孔滤膜过滤，取滤 液2mL与0.1mL胆碱显色剂、0.1mL胆碱氧化酶溶液室温反应2.5h. 在反应混合物中加入2.0mL去离子水，离心得到澄清透亮的粉红色溶 液，最后于a500检测吸光值。500nm酶活定义：pH=8.0、T=35C时，磷脂酰丝氨酸合成酶1h内催化 水解L-a-卵磷脂释放1.0ymol的胆碱所需要的酶量。所需药品清单L-a-卵磷脂SDSNaOAc乙醇4-氨基氨替比林苯酚过氧化酶Tris HClCaCl2胆碱氧化酶
磷脂酰丝氨酸合酶酶活测定方法
