人巨细胞病毒UL抗体检测试剂盒的研制及其初步应用

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3、用影印、缩印或扫描等复印手段保存、汇编学位论文；2、本人授权学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。送交学位论文时间选择（请在下面相应栏内打“” ）：答辩后即可送：是延迟一年后送：延迟二年后送：延迟三年后送：否论文作者签名：导 师 签 名 ：日期：日期：年年月月日日 硕士学位论文人巨细胞病毒UL148抗体检测试剂盒的研制及其初步应用The development and application of the HCMV UL148IgM antibody detection kit专 业： 儿科学研究生： 蔡丽君导 师： 王 波 教授广州医科大学广州二一六年五月

4、中文摘要目录中文摘要. 3ABSTRACT. 6缩略词表. 9第一章 前言.101. 简介. 102. HCMV 背景概述. 112.1 HCMV 生物学特征.112.2 HCMV 的组织嗜性与宿主年龄和免疫状况密切相关. 123. HCMV UL148 基因研究现况.134. 本课题研究的意义.14第二章 技术路线.15第三章 仪器及材料.161. 主要仪器. 162. 实验材料. 172.1 主要试剂.172.2 其他主要试剂配方.17第四章 研究内容.181HCMV UL148 基因的抗体制备.181.1 实验材料.181.2 免疫动物及血清抗体制备.182HCMV UL148 基因 B

5、 细胞优势抗原表位的确定.192.1 实验材料.192.2 Western Blot 鉴定 HCMV UL148 基因抗体.193HCMV UL148 抗体检测方法的建立. 213.1 实验材料.213.2 方阵滴定法选择包被抗原及血清标本的最佳稀释浓度. 213.3 连续稀释法选择二抗的最佳稀释浓度.213.4 包被温度与时间、封闭液及显色时间的选择.224. HCMV UL148 抗体检测试剂盒的研制. 224.1 试剂盒的制备.224.2 模拟标本最低检出限及检测体系精密度实验.234.3 试剂盒稳定性研究.234.4 RT-PCR 检测 UL148 基因的表达研究试剂盒的灵敏性和特异性

6、. 235. HCMV UL148 抗体检测试剂盒应用于临床 HCMV 感染儿童.255.1 实验材料.255.2 检测标本的收集与处理.265.3 临界值的确定.265.4 分析 HCMV UL148 基因的表达在临床中的意义. 26第五章 结果与分析.281. HCMV UL148 基因的抗体制备. 281.1 酶联免疫法（ELISA）对 pAb 效价的测定结果. 282HCMV UL148 基因 B 细胞优势抗原表位的确定.281 广州医科大学硕士学位论文2.1 Western Blot 鉴定 HCMV UL148 基因抗体结果. 283. HCMV UL148 抗体检测方法的建立. 2

7、93.1 方阵滴定法选择包被抗原 P3 和血清标本的最佳稀释度结果.293.2 二抗的选择及最佳工作浓度的测定结果.293.3 包被温度与时间、封闭液及显色时间的选择结果. 304. HCMV UL148 抗体检测试剂盒的研制. 314.1 模拟标本最低检出限及检测体系精密度实验.314.2 试剂盒稳定性研究结果.324.3 RT-PCR 鉴定 UL148 的表达研究试剂盒的灵敏性和特异性结果. 324.4 试剂盒的组装与说明书.335. HCMV UL148 抗体检测试剂盒检测 HCMV 感染儿童结果.345.1 标本的收集.345.2 临界值的确定.345.3 分析 HCMV UL148

8、基因的表达在临床中的意义. 34第六章 讨论.381HCMV 的感染及检测.382检测 HCMV UL148 抗体方法的建立及试剂盒的初步研制.383. 分析 HCMV UL148 抗体检测试剂盒检测结果及其临床意义.40第七章 结论和展望.421结论. 422研究不足与展望.42参考文献. 43综 述. 47参考文献. 54附 录. 56研究生期间发表论文.56致谢. 572 中文摘要中文摘要目的:在前期关于人巨细胞病毒（HCMV）临床病毒株 UL148 基因结构功能系列研究的基础上，制备 UL148 抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，明确该功能基因的优势抗原表位，建立检测 H

9、CMV UL148 抗体的方法，优化检测体系，进行灵敏性与特异性的评价，观察不同临床表型与检测结果的相关性。探讨 HCMV 临床病毒株 UL148 抗体检测试剂盒的开发与应用的前景。方法：1. 以课题组前期研究为基础，将应用生物信息学方法筛选的重复性好、抗原指数高的 3 条多肽（P1、P2、P3）作为 HCMV UL148 基因候选 B 细胞表位，本课题通过化学合成 3 条抗原多肽及免疫动物方法，获取免疫兔血清制备多克隆抗体，应用 Western Blot 鉴定 HCMV UL148 抗体，确定 HCMV UL148 B细胞优势抗原表位。2. 化学合成 UL148 B 细胞优势抗原表位作为包被

10、抗原，通过方阵滴定法选择包被抗原和血清样本的最佳工作浓度，通过连续稀释法确定酶标二抗的最佳工作浓度，然后包被酶标板制作试剂盒，建立检测 HCMV 临床病毒株 UL148抗体的方法。3. 以经广东省妇幼保健院临床确诊为 CMV 性肺炎或 CMV 性肝炎及实验室检测 HCMV 阳性的血清标本作为实验组，以未感染 HCMV 的正常健康儿童作为阴性对照组，应用 HCMV UL148 抗体检测试剂盒分别对其进行检测；通过 RT-PCR 鉴定 UL148 基因的表达，研究 HCMV UL148 抗体检测试剂盒的灵敏性及特异性。4. 将实验组分别按年龄、性别、病种、肝酶学指标、HCMV-IgM 值分组，分析

11、HCMV UL148 抗体检测情况，应用统计学方法分析 HCMV UL148 表达在各组中的差异，观察不同临床表型与 UL148 抗体阳性的相关性，明确 HCMVUL148 的临床意义。结果：1. P1(HCMV UL148265-275)、P2（HCMV UL14818-25）、P3（HCMV UL148221-229）3 广州医科大学硕士学位论文三条多肽均能免疫兔子产生抗体，且抗体效价随着免疫次数增加而升高。经Western Blot 鉴定，证实仅 P3 段多肽免疫获得抗体能与临床病毒株 HCMVUL148 蛋白发生特异性结合，成为 HCMV UL148 B 细胞优势抗原表位。2. 确定包

12、被抗原 P3（1mg/ml）最佳稀释度为 1：160，血清样本最佳稀释度为1：100，酶标二抗的最佳稀释度为 1：6000，优化了检测体系，建立了检测HCMV UL148 抗体的方法。3. 共收集标本 67 例，其中实验组 52 例，对照组 15 例，当临界值为 0.246 时，52 例感染 HCMV 患儿血清用 UL148 抗体检测试剂盒检测出阳性例数为 22例，阴性为 30 例；15 例未感染 HCMV 的健康儿童血清中用 UL148 抗体检测试剂盒检测出阳性例数为 0 例，阴性例数为 15 例；HCMV-UL148 抗体检测试剂盒的灵敏性为 81.5%，特异性为 100%。4. 将实验组

13、按年龄、性别、病种、肝酶学指标、HCMV-IgM 值分组，分析使用HCMV UL148 抗体检测试剂盒的结果，发现：3 月龄组 UL148 抗体阳性检出数高于 3-12 月龄组，经卡方检验两组检查结果有统计学意义（P0.05）；CMV 性肝炎组 UL148 抗体阳性检出数高于 CMV 肺炎组，经卡方检验两组检查结果有统计学意义（P0.05）；UL148 抗体阳性组肝酶学 AST、ALT、GGT 三项指标均高于 UL148 抗体阴性组，两组相比有统计学意义（P0.01）；按性别及 IgM 值等分组 UL148 抗体阳性检出率无明显差异。结论：1. 经免疫动物及 Western Blot 鉴定，确

14、定了 P3 为 HCMV UL148 B 细胞优势抗原表位，可作为 UL148 抗体检测试剂盒的包被抗原。2. 本课题通过确定 HCMV UL148B 细胞优势抗原表位，建立了检测 HCMVUL148 抗体的方法，确立了优化检测体系，进行了灵敏性与特异性的评价，具有开发研制成人巨细胞病毒 UL148 抗体检测试剂盒的前景。3. (1) HCMV UL148 基因的表达可能与年龄有关，3 月龄内感染 HCMV 的患儿其 UL148 基因可能呈强表达；(2) HCMV UL148 基因的表达可能与 CMV 性肝炎相关；(3) HCMV UL148 基因的表达可能与肝酶异常相关；（4）HCMVUL1

15、48 基因表达与性别、IgM 浓度无相关性。关键词：人巨细胞病毒；临床病毒株；UL148；IgM 抗体；酶联免疫吸附试验；4 中文摘要ELISA；试剂盒5 广州医科大学硕士学位论文ABSTRACTObjectiveBased on the early research of the structure and function of UL148 gene of Human Cytomegalovirus clinical strain, this research is to establish an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (EL

16、ISA) kit for detecting human cytomegalovirus(HCMV) UL148 IgM antibody in serum, to clear the best B cell antigenepitope of UL148, to optimize the conditions of ELISA detecting HCMV UL148 antibody, to analyze the sensitivity and specificity of this kit. This objective is to observe the correlation be

17、tween the detection results and different clinical phenotypes, which could help to explore the development and application ofthe kit for detecting HCMV UL148 IgM antibody.Methods1. Based on our previous study, successfully screened three HCMV UL148 genecandidate B cell epitope which had good repeata

18、bility and high antigenic index as theHCMV UL148 gene candidates for B-cell epitopes. This study synthesized threeantigenic peptides through chemical process, and we injected to the rabbits, thenobtained the immune serum of polyclonal antibody. The best B cell antigen epitope ofHCMV UL148 has been i

19、dentified by the Western Blot.2. The best B cell antigen epitope of UL148 were synthesized by the chemical method, which could be the coating antigen. After screening the best condition of the dilution of P3 antigen coated, serum samples and horseradish peroxidase(HRP) labeled anti-human IgM for thi

20、s test, the established ELISA method could detect the HCMV UL148 IgM antibody.3. The serum specimens which had been diagnosed with CMV pneumonia or CMVhepatitis and laboratory detection of HCMV positive from Guangdong ProvinceWomen and Children Hospital were used as the experimental group, the norma

21、lhealthy children without HCMV infection were the negative control group. Analysisof different groups of serum samples were tested by the established method. Weanalyze the sensitivity and specificity of this kit by RT-PCR.4. The experimental group were grouped by age, gender, disease, hepatic enzyme

22、 andHCMV IgM value respectively. With analyzing the expression of HCMV UL1486 缩略词表gene in each group by applying statistical methods, and observing the correlationbetween the detection results and different clinical phenotypes, the clinicalsignificance of HCMV UL148 will be more clear.Results1. The

23、three peptides, P1(HCMV UL148265-275)、P2（HCMV UL14818-25）、P3（HCMV UL148221-229）, could stimulate rabbits body to produce antibodies, antibody titer increased with the elevation of the immunization times. Identified by the Western Blot, the test result of the P3 peptide (HCMV UL148221-229) antibody a

24、ppeared positive, however, the P1, P2 peptide antibody were negative. Therefore P3 peptide was the best B cell antigen epitope of HCMV UL148.2. The optimal dilution of coating antigen P3, serum sample and HRP-IgM were1:160, 1:100 and 1:6000 respectively. Optimized detection system and the establishe

25、d ELISA method could detect the HCMV UL148 IgM antibodies.3. A total of 67 specimens were collected, in the experimental group 52 cases, 15 cases in control group. When the cut-off value of this method was 0.246, 67 samples were tested with the HCMV UL148 antibody ELISA kit. The experimental groups

26、positive results of this method was 22 and the negative resultswas 30, the control groups positive results of this method was 0 and the negative results was 15. The sensitivity of our reagent is 81.5%(22/27), and the specificity of our reagent is 100%(15/15).4. Divided by age, gender, disease, hepat

27、ic enzyme, HCMV IgM value in the experimental group, the project has found that children under 3 months with CMVhepatitis had a high positive detection rate by analyzing the results of usingUL148 antibody detection kit. The expression of UL148 gene is related to thedegree of abnormal liver enzymes,

28、which is less related to the gender and HCMV IgM value.Conclusion1. With the verification of immune animals and Western Blot, P3 peptide has been identified as the best B cell antigen epitope of HCMV UL148, which couldbe used as coating antigen for the UL148 IgM antibody test kit.2. This study set u

29、p a method of detecting HCMV UL148 IgM, established the optimum detection system by determining the advantage B cell epitope of HCM7 广州医科大学硕士学位论文V UL148, which has the prospect to develop into a new ELISA for detectionof HCMV UL148 IgM antibody.3. Due to a high positive detection rate of Children un

30、der 3 months, we considered that the expression of UL148 gene is age related, especially infants less than 3 months. Children with CMV hepatitis had a high positive detection rate, itcould be seen that the expression of UL148 gene would result in liver damage, which is also related to the degree of

31、liver enzymes, while less related to the gender and HCMV IgM value.Key Words: HCMV; Clinical Isolates; UL148; IgM; Enzyme linked immunosorbentassay; ELISA; Kit8 缩略词表缩略词表HCMVCIDBpHuman cytomegalovirus人巨细胞病毒巨细胞包涵体病碱基对cytomegalic inclusion diseasebase pairCPEDNARNAODcytopathic effect细胞病变效应脱氧核糖核酸核糖核酸deo

32、xyribonucleic acidribonucleic acidoptical density光密度ORFPCRULopen reading framepolymerase chain reactionunique long开放阅读框聚合酶链反应长的独特序列非感染性包膜颗粒免疫球蛋白多克隆抗体即刻早期NIEPSIgnoninfectious enveloped particlesimmunoglobULinpAbIEPolyclonal antibodyimmediate-earlyEearly早期Llate晚期BSAKLHAPBovine serum albuminKeyhole lim

33、pet hemocyaninAmmonium persULphatepolyvinylidene fluorideHorseradish Peroxidaseenzyme linked immunosorbent assayminute牛血清白蛋白血兰蛋白过硫酸铵PVDFHRPELISAmin聚偏二氟乙烯辣根过氧化物酶酶联免疫吸附试验分钟rpmrevolutions per minutephosphate buffer salinephosphate buffer solution- tween-20每分钟转数磷酸盐酸缓冲液磷酸盐洗涤缓冲液PBSPBST9 广州医科大学硕士学位论文第一章 前言

34、1. 简介人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）属疱疹病毒科乙组疱疹亚科，具有潜伏、活动的生物学特征1-2，是引起先天性及围生期感染的重要病原微生物之一，婴幼儿因免疫系统发育不完善成为易感人群，HCMV 感染可引起婴幼儿多脏器、多系统损害，造成全身性感染，甚至危及生命。肺、肝脏、神经系统是巨细胞病毒感染的主要靶位；此外 CMV 还可侵犯免疫系统、 血液系统、神经系统可导致严重后遗症3。近年有研究证实 HCMV 还与多种恶性肿瘤密切相关：包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、脑胶质瘤等肿瘤中存在 HCMV 基因的表达，推测 HCMV 可能是一种新的人类肿瘤相关病毒

35、4-5。因此 HCMV 感染的早期检测及活化指标的监测具有非常重要的临床意义。目前临床上诊断 HCMV 感染的方法有检测早期抗原、HCMV DNA 和 IgM 抗体。而检测抗体需要抗原性强、特异性好的包被抗原，由于国内一般采用分离自病毒感染细胞的蛋白作为抗原，其抗原表达和病毒生长存在差异，再加上混有成纤维细胞成分，易导致检测结果不一致和假阳性6-7。且上述的检测方法仅能进行血清中抗体定性及定量或 DNA 滴度的检测，均不能说明是否与临床表现差异性及受累脏器相关。二十世纪九十年代，研究学者8发现与实验室病毒株 AD169 比较，HCMV 临床低传代病毒株存在 1 个 15kb 的独特区域（UL/

36、B），包含至少 19 个开放阅读框（openreading frame, ORF）(UL133UL151)，并证实该结构区域在无致病力的实验室病毒株AD169 是不存在的，推测这些丢失的基因片段功能与 HCMV 的致病性密切相关（图1）。目前有研究证实：UL138 基因为 HCMV 体外潜伏感染所必须9；UL139 基因编码膜糖蛋白10；UL141 和 UL142 基因编码蛋白与逃避 NK 细胞识别相关11-12；UL144基因和肿瘤坏死因子受体超家族成员相关13-14；UL146 和 UL147 基因编码 CXC 趋化因子类似物15-16。关于 UL148 基因的研究中发现恒河猴 CMV 的

37、基因中：与 HCMVUL148 基因高度同源的 Rh159 基因与 Rh CMV 的细胞嗜性相关17，但人类 CMV 的UL148 基因功能尚不明确。10 第一章 前言图 1 HCMV 基因组结构2. HCMV 背景概述巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)是一类具有严格种属特异性且在自然界普遍存在的病毒，包括人、猪、牛鼠、猫、马等巨细胞病毒，致人类疾病的为人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)，与其他疱疹病毒一样，具有潜在的致癌性18，该病毒在世界各地各种族人群中都普遍存在，其感染率很高，一旦侵入人体后将长期存在。我国系巨细胞病毒感染的高发地带

38、，一般人群抗体阳性率高达 90%，孕妇为 95%左右，儿童至周岁时抗体阳性率已达 80%左右19-20。2.1 HCMV 生物学特征HCMV 病毒粒子从内向外依次由基因组、衣壳、被膜及包膜构成（图 2）。病毒衣壳是一个正二十面体立体结构，衣壳外由厚约 10nm 的一层被膜包裹，而此被膜又被含糖蛋白的磷脂双分子层结构的包膜所包围21，这部分糖蛋白是病毒侵入宿主细胞的一个重要结构22，分别由 6 种病毒源基因编码，为 gB（gpUL55）、gN（gpUL73）、gO（gpUL74）、gH（gpUL75）、gM（UL100）、gL（gpUL115）23。图 2 HCMV 病毒结构11 广州医科大学硕

39、士学位论文人巨细胞病毒感染的宿主细胞可释放 3 种不同的病毒颗粒：感染性病毒粒子、非感染性包膜颗粒及致密体24。只有前者具有感染性，其中包膜颗粒由包膜、被膜、衣壳蛋白组成，但是缺乏病毒基因组，是有缺陷的病毒颗粒；致密颗粒大量存在于被感染细胞的胞质中，无核衣壳和病毒 DNA，由数量丰富的皮层蛋白构成，外部被含病毒糖蛋白的包膜所包裹。这 3 种病毒颗粒产生的数量是由病毒株的种类及宿主细胞的培养代数所决定的。在人巨细胞病毒（HCMV）感染机体过程中，基因的表达具有一定的时序性，分为即刻早期（Immediate Early, IE）、早期（Early, E）以及晚期（Later, L）25。其中 IE 基因是 HCMV 感染时最早被活化的基因，是 HCMV 基因组复制的最重要启动子，其编码的产物可与细胞 DNA 结合或与细胞调控因子作用调节宿主细胞基因的表达，可促进病毒早期和晚期基因的启动子与病毒 DNA 多