细胞工程1植物细胞

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1、生物工程概论生物工程概论第三章第三章 细胞工程细胞工程-植物细胞工程植物细胞工程College of Chemical Engineering,GuiZhou University 1 1 概述概述 2 2 植物细胞工程植物细胞工程一、植物组织培养一、植物组织培养二、植物细胞培养二、植物细胞培养三、人工种子三、人工种子四、植物细胞融合四、植物细胞融合 19721972年卡尔森等通过两个烟草品种之间原生年卡尔森等通过两个烟草品种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。19781978年梅尔彻斯年梅尔彻斯(Melchers)(Melchers)等首次获得了番

2、等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种茄和马铃薯的属间体细胞杂种“Potamato”“Potamato”。目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，获得了有价值的新品系或育种上有用的新材获得了有价值的新品系或育种上有用的新材料。料。1 1 概述概述 一、细胞工程的概念一、细胞工程的概念 是指在细胞水平上，以细胞生物学理论和技术为基础，结合现代工程技术手段以及其他学科的科学原理和技术，研究、开发和利用细胞的现代生物技术

3、。细胞工程细胞工程 植物组织和细胞培养技术植物组织和细胞培养技术 干细胞技术干细胞技术动物组织和细胞培养技术动物组织和细胞培养技术 细胞融合技术细胞融合技术 细胞核移植技术细胞核移植技术 胚胎移植技术胚胎移植技术细胞工程细胞工程:P54:P54微生物细胞工程、微生物细胞工程、植物细胞工程和植物细胞工程和动物细胞工程动物细胞工程根据研究对象不同，根据研究对象不同，可将细胞工程分为可将细胞工程分为（一）基本概念及研究进展（一）基本概念及研究进展 1.1.定义定义 植物组织培养：植物组织培养：是指将植物机体的某一部分是指将植物机体的某一部分(包括器官、组织等包括器官、组织等)取出，使其在无菌和人为控

4、制外取出，使其在无菌和人为控制外因（养分、光照、温度、湿度等）条件下进行培养，因（养分、光照、温度、湿度等）条件下进行培养，从而使其分化、发育出整体植株的技术。从而使其分化、发育出整体植株的技术。2 2 植物细胞工程植物细胞工程 一、植物组织培养一、植物组织培养2.2.研究进展研究进展植物组织培养的理论依据主要有两点：植物组织培养的理论依据主要有两点：1919世纪世纪3030年代施莱登和施旺提出的年代施莱登和施旺提出的细胞学说细胞学说，即细胞是，即细胞是生物有机体的基本结构单位这一理论，使人们想到并生物有机体的基本结构单位这一理论，使人们想到并试图应用无菌培养方法来培养植物的离体部分试图应用无

5、菌培养方法来培养植物的离体部分,在人工在人工控制条件下来研究其生长、发育和分化的规律。控制条件下来研究其生长、发育和分化的规律。1902年，德国植物学家年，德国植物学家Haberlandt提出了提出了植物细胞植物细胞全能性学说全能性学说。植物的器官和。植物的器官和组织可以不断分割，直至分组织可以不断分割，直至分到单个细胞而不影响细胞增到单个细胞而不影响细胞增殖的观点。并设想离体细胞殖的观点。并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力。具有再生完整植株的潜力。19341934年美国的年美国的WhiteWhite，利利用番茄根建立了第一个用番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，活跃生长的无性繁殖系，发

6、现发现B B族维生素对培养的族维生素对培养的离体根生长具有重要作离体根生长具有重要作用。用。创立了创立了 1943年年White发表了植物组织培养手册的专著，发表了植物组织培养手册的专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。19391939年，年，GautheretGautheret连续培养胡萝卜根形连续培养胡萝卜根形成层首次成功成层首次成功 1948 年，年，Skoog和崔徵通和崔徵通过对烟草茎切段和髓培养组过对烟草茎切段和髓培养组织的研究，织的研究，确定了腺嘌呤确定了腺嘌呤生长素的比例是控制芽和根生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。形成的主要

7、条件之一。1956年年Miller等发现了激动素。控制等发现了激动素。控制器官分器官分化的激素模式变为激动素生长素的比例关系化的激素模式变为激动素生长素的比例关系。指出其能有力诱导愈伤组织分化指出其能有力诱导愈伤组织分化,促进组培发展。促进组培发展。1958年，英国科学家年，英国科学家Steward 等用进行悬浮培养，成功诱导出胚等用进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，状体并分化为完整的小植株，首次获得植株再生成功首次获得植株再生成功。使细胞使细胞全能性理论得到证实，这是植物组培的第一次突破。全能性理论得到证实，这是植物组培的第一次突破。细胞全能性细胞全能性 已经分化的体细胞具

8、有使后代细胞形成完整已经分化的体细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能，细胞的这种特性叫做细胞的全能个体的潜能，细胞的这种特性叫做细胞的全能性。性。生物体的每一个体细胞都包含有该物种所特有生物体的每一个体细胞都包含有该物种所特有的全套遗传信息，都有发育成为完整个体所必需的全的全套遗传信息，都有发育成为完整个体所必需的全部基因。部基因。受精卵的全能性最强。其次是生殖细胞，再受精卵的全能性最强。其次是生殖细胞，再次是体细胞次是体细胞 在离体时，在一定的营养物质、激素、其他外界在离体时，在一定的营养物质、激素、其他外界条件下，可能表现出全能性，发育成完整的植株。条件下，可能表现出全能性，发育成完整的植

9、株。植物组织培养的一般程序：植物组织培养的一般程序：脱分化再分化诱导根、芽顶诱导根、芽顶端分生组织端分生组织通过悬浮液培养分散成单细胞通过悬浮液培养分散成单细胞离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽小植株小植株脱分化脱分化再分化再分化植物组织培养植物组织培养胚状体胚状体小植株小植株再分化再分化单细胞单细胞通过悬浮培养分散成通过悬浮培养分散成包以人工包以人工种皮，形种皮，形成人工种成人工种子子1.1.预备阶预备阶段段2.2.诱导诱导去分化去分化阶阶段段3.3.继继代增殖代增殖阶阶段段4.4.生根成芽生根成芽阶阶段段5.5.移栽成活移栽成活阶阶段段（二）植

10、物组织组织培养养的操作技术术 P56切取切取形成层形成层无菌无菌接种接种诱导愈伤组织诱导愈伤组织的形成的形成试管苗的形成试管苗的形成培养室培养室移栽移栽诱导去分化阶段诱导去分化阶段再分化再分化预备阶段预备阶段继代增殖阶继代增殖阶段段生根成芽阶段生根成芽阶段移栽成活阶段移栽成活阶段A Microspores isolated from banana anthers.Bar 14 m.B Development of callus from anthers after 5 months on induction medium.Bar 2 mm.C Androgenic embryos formed

11、 on calli.Bar 4 mm.D Haploid plantlets regenerated from anthers.Bar 3 cmAssani et al.Plant Cell Rep 2003,21,5115161.1.预备阶预备阶段段（1 1）选择合适的外植体。选择时应考虑的因素：）选择合适的外植体。选择时应考虑的因素：外植体的选择一般以幼嫩的组织或器官为宜外植体的选择一般以幼嫩的组织或器官为宜。（2 2）除去病原菌和杂菌。）除去病原菌和杂菌。外植体外植体自来水多次漂洗自来水多次漂洗消毒剂处理消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干无菌滤纸吸干由于物种种的不同、外植

12、体的差异异，组织组织培养养的培养养基也是多种种多样样，但它们它们通常都包括以下三大类组类组成成分：含量丰富的基本成分，如蔗糖或葡萄糖高达达每升30g，以及氮氮、磷、钾钾、镁镁等。微量无机物，如铁铁、锰锰、硼酸等。微量有机物，如激动动素、吲哚吲哚乙酸、肌醇等。（3 3）配制适宜的培养基。）配制适宜的培养基。分裂素分裂素生长素生长素问：培养基的成分？问：培养基的成分？碳源碳源,氮源氮源 ,无机盐无机盐,生长因子生长因子,水水,除此，培养基中除此，培养基中还需加入植物激素或其类似物还需加入植物激素或其类似物 培养基培养基 MSMS培养基培养基:其特点是无机盐和离子浓度较高；其特点是无机盐和离子浓度较

13、高；B5B5培养基培养基:其特点是含有较低的铵；其特点是含有较低的铵；WhiteWhite培养基培养基:其特点是无机盐低，适于生根；其特点是无机盐低，适于生根；N6N6培养基培养基:其特点是其特点是KNOKNO3 3和（和（NHNH4 4）2 2SOSO4 4含量较高含量较高,适于花药培养；适于花药培养；KMKM8P8P培养基培养基:其特点是有机成分较多，适于其特点是有机成分较多，适于 原生质体培养。原生质体培养。培养基多以命名人的名字命名。培养基多以命名人的名字命名。目前，比较流行的培养基有目前，比较流行的培养基有：生长素生长素 吲哚乙酸吲哚乙酸(IAA)(IAA)，2,42,4二氯苯氧乙酸

14、二氯苯氧乙酸(2,4-D)(2,4-D)，奈乙，奈乙 酸酸(NAA)(NAA)，吲哚丁酸吲哚丁酸(IBA)(IBA)。生长素的生理作用生长素的生理作用（1）既能促进生长，也能抑制生长；（2）既能促进发芽，也能抑制发芽；（3）既能防止落花落果，也能疏花疏果。浓度较低浓度较低,促进生长促进生长;浓度过高浓度过高,抑制生长甚至杀死植物。抑制生长甚至杀死植物。生长素的生理效应生长素的生理效应：使胞壁酸化，增加可塑性，导致细胞伸长变；促进RNA和蛋白质的合成，保证可持续生长。植植 物物 激激 素素植物对生长素的敏感程度如何呢植物对生长素的敏感程度如何呢?（1）营养器官生殖器官）营养器官生殖器官（2）根芽

15、茎）根芽茎（3）幼嫩细胞衰老细胞）幼嫩细胞衰老细胞（4）双子叶植物单子叶植物）双子叶植物单子叶植物植物生长素错当农药植物生长素错当农药 晚稻疯长比人高晚稻疯长比人高当当培养养基中CTK/IAA的比值值高时时，伤组织伤组织形成芽；2.2.分裂素分裂素 6-6-苄基嘌呤苄基嘌呤(6-BA)(6-BA)，激动素，激动素(kinetin,KT)(kinetin,KT)，玉米，玉米素，嘌呤衍生物素，嘌呤衍生物,6-,6-呋喃氨基嘌呤，呋喃氨基嘌呤，K N K N。19571957年斯年斯库库格和米勒在格和米勒在进进行烟草的行烟草的组织组织培培养时发现养时发现：吲哚乙酸吲哚乙酸(IAA(IAA)，将拟南芥

16、组织置于含生长素将拟南芥组织置于含生长素IBA和细胞和细胞分裂素的环境中诱导愈伤组织的产生分裂素的环境中诱导愈伤组织的产生 生长素只促进核的分裂生长素只促进核的分裂(因促进了因促进了DNADNA的合的合成成)，而与细胞质的分裂无关。，而与细胞质的分裂无关。而细胞分而细胞分裂素主要是对细胞质的分裂起作用，裂素主要是对细胞质的分裂起作用，所以，细胞分裂素促进所以，细胞分裂素促进细胞分裂的效应只有细胞分裂的效应只有在生长素存在的前提在生长素存在的前提下才能表现出来。下才能表现出来。外植体外植体是植物组织培养中用来进行离体无菌培养是植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和

17、原生质体的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。组织培养的第一步就是让这些器官或组织切断等。组织培养的第一步就是让这些器官或组织切断去分化去分化.所谓所谓去分化（也叫脱分化）去分化（也叫脱分化）是指离体的植是指离体的植物组织器官或细胞，在物组织器官或细胞，在外源的生长素类物质的外源的生长素类物质的诱导下重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，形诱导下重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，形成一团结构疏松、颜色浅而透明的、高度液泡成一团结构疏松、颜色浅而透明的、高度液泡化的、呈无定形状态的薄壁细胞群的愈伤组织化的、呈无定形状态的薄壁细胞群的愈伤组织的过程。的过程。2.2.诱导诱导去分化去分化阶阶段段愈

18、伤组织细胞的状态愈伤组织细胞的状态愈伤组织愈伤组织 是指在离体培养过程中形成的是指在离体培养过程中形成的具有分生能力具有分生能力的的一团不规则细胞，一团不规则细胞，它具有它具有再分化再分化成为完整植物体成为完整植物体的潜能，一般在的潜能，一般在外植体的切面处外植体的切面处产生。产生。愈伤组织：愈伤组织：在人工培养基上由外植在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排长的薄壁细胞（细胞排列疏松、无规则）。列疏松、无规则）。分化程度低，属分化程度低，属于胚胎干细胞。于胚胎干细胞。分化程度高，属分化程度高，属于组织干细胞。于组织干细胞。Arabidopsis To

19、bacco3.0 mg/L 2,4-DGenotypic Effects on Callus Morphology拟南芥拟南芥2,42,4二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸(2,4-D)(2,4-D)Medium Effects on Tobacco Callus Morphology0.1 mg/L kinetin3.0 mg/L 2,4-D3.0 mg/L 2-iP2.0 mg/L IAAfriable calluscompact callus异戊烯基腺嘌异戊烯基腺嘌呤，属于细胞呤，属于细胞分裂素分裂素愈伤组织的形态发生主要有愈伤组织的形态发生主要有不定芽方式不定芽方式和和胚状体胚状体方式两种。方式

20、两种。不定芽方式不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。成芽和根。胚状体方式胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构程，直接产生类似于胚的结构，叫做叫做胚状体胚状体。不定芽方式和胚状体方式是植物组织培养中最常见和最重要的两种方式。胚状体方式

21、比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。继继代培代培养养是愈是愈伤组织伤组织在培在培养养基上生基上生长长一段一段时时间间后，后，营养营养物枯竭，水分散失，物枯竭，水分散失，并并已已经积经积累了一累了一些代些代谢产谢产物，此物，此时时需要需要将这将这些些组织转组织转移到新的培移到新的培养养基上，基上，这种转这种转移移称为继称为继代培代培养养。3.3.继代增殖阶段继代增殖阶段 愈伤组织伤组织只有经过经过重新分化才能形成胚状状体，继继而长长成小植株。再分化是指愈伤组织继续伤组织继续培养养，又可以重新分化成根或芽等器官的过过程。4.4.生根成芽生根成芽阶阶

22、段段5.5.移栽成活移栽成活阶阶段段生长于人工照明玻璃瓶生长于人工照明玻璃瓶中的小苗，要适时移栽中的小苗，要适时移栽室外以利生长。室外以利生长。去分化去分化再分化再分化形成植株形成植株愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织分化出芽分化出芽形成试管苗形成试管苗实例：非洲紫罗兰的组织培养实例：非洲紫罗兰的组织培养 决定植物细胞脱分化、再分化的关键因素是什么决定植物细胞脱分化、再分化的关键因素是什么?影响脱分化的一个重要因素是植物激素。当细胞分影响脱分化的一个重要因素是植物激素。当细胞分裂素与生长素共同使用时，能强烈促进愈伤组织的形成，裂素与生长素共同使用时，能强烈促进愈伤组织的形成，而两者不同的浓度配比

23、在再分化过程中，分别对诱导而两者不同的浓度配比在再分化过程中，分别对诱导根或芽的产生起关键作用。当细胞分裂素与生长素浓度比根或芽的产生起关键作用。当细胞分裂素与生长素浓度比高时，有利于芽的发生；浓度比低时，有利于根的发生。高时，有利于芽的发生；浓度比低时，有利于根的发生。胚状体是怎样形成的？培养胚状体有何意义？胚状体是怎样形成的？培养胚状体有何意义？愈伤组织的形态发生主要有不定芽方式和胚状体方式两种。愈伤组织的形态发生主要有不定芽方式和胚状体方式两种。而后者需要在愈伤组织形成后，对其进行处理，形成分散的单而后者需要在愈伤组织形成后，对其进行处理，形成分散的单个细胞，再诱导其分化出具有胚芽、胚轴

24、、胚根的胚状体，进个细胞，再诱导其分化出具有胚芽、胚轴、胚根的胚状体，进而发育成完整植株。诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能而发育成完整植株。诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮制成人工种子可以解力的胚状结构，包裹上人造种皮制成人工种子可以解决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。马铃薯块茎外植体直接分化芽马铃薯块茎外植体直接分化芽植物细胞的大规模培养植物细胞的大规模培养植物细胞植物细胞(组织组织)培养培养植物组织培养与有性生殖相比，有什植物组织培养与有性生殖相比，有什么么优势：优势：繁殖速度快；繁殖

25、速度快；保持亲本的优良性状（因为是无性生殖）；保持亲本的优良性状（因为是无性生殖）；培育无病毒的植株培育无病毒的植株 不受自然生长季节的限制（因为在具有一定不受自然生长季节的限制（因为在具有一定人工设施的室内生产）。人工设施的室内生产）。二、植物细胞培养二、植物细胞培养 是指在离体条件下，将愈伤组织或其他容是指在离体条件下，将愈伤组织或其他容易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体及相养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体及相关产物的一种技术

26、。关产物的一种技术。植物细胞培养植物细胞培养p58植物细胞（组织）培养流程植物细胞（组织）培养流程悬浮细胞培养悬浮细胞培养提取纯化提取纯化产物产物收集细胞收集细胞通过植物组织培养的药物：奎宁、长春碱、洋地黄、紫草素、通过植物组织培养的药物：奎宁、长春碱、洋地黄、紫草素、人参皂甙等人参皂甙等药物制剂药物制剂植物细胞培养的方法植物细胞培养的方法 植物细细胞培养养的方法，根据培养对养对象，植物细细胞培养养主要有悬浮悬浮细细胞培养养（单细单细胞培养养）、单单倍体培养养、原生质质体培养养等。按照培养养系统统可分为为悬悬浮培养养系统统、固定化培养养系统统等。单单倍体培养养：主要是指花药药培养养，即将将花药

27、药在人工培养养基上进进行培养养，从从小孢孢子（雄性生殖细细胞）直接发发育成胚状状体，然后长长成单单倍体植株；或通过组织诱导过组织诱导分化出芽和根，最终长终长成植株。单倍体植株经单倍体植株经人为加倍后可得到完全纯合的个体。人为加倍后可得到完全纯合的个体。原生质质体培养养：是将将植物的体细细胞经过纤维经过纤维素酶等处处理后去掉细细胞壁，获获得的原生质质体在无菌培养养基上上长长、分裂，最终长终长成植株。悬浮细胞培养：悬浮细胞培养：在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。适合于进行产业化大规模细胞

28、培养，制取植物代谢产物。一、悬悬浮培养养系统统（cell suspension culture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。适于悬浮培养适于悬浮培养适于再生植株适于再生植株适于悬浮培养适于悬浮培养细细胞悬悬浮系的建立二、二、单细胞培养单细胞培养1、平板培养养2、看护护培养养3、微室培养养4、双层滤纸双层滤纸培养养 悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析，也就不能悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析，也就不能进行定点选择。进行定点选择。因此，在

29、进行细胞株（种子细胞）选择和需要因此，在进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上的单细胞对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性，单细胞培养还比较困难。培养。由于植物细胞的团聚性，单细胞培养还比较困难。平板培养平板培养(plate culture)：将一定密度的悬浮细胞将一定密度的悬浮细胞接种接种到一到一薄层固体培养基中进行培养的技术。薄层固体培养基中进行培养的技术。单细胞的分离：单细胞的分离：用于平板培养的用于平板培养的小细胞团不能超过小细胞团不能超过6个细个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。胞，所以过滤时筛网

30、的网孔大小要合适。单细胞悬浮液的制备：单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经低速离心，培养液分离的单细胞经低速离心，培养液洗涤洗涤2次后，调整密度为次后，调整密度为5105ml。植板：植板：将将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份份35的的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，厚度固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，厚度约约12mm。封口封口：用石蜡膜封培养皿。用石蜡膜封培养皿。1 1、细胞平板培养、细胞平板培养看护培养（看护培养（nurse culture）：）：是由是由Muir1954年设计的。年设计的。操作方法：操作方法：在固体培养基上

31、置入一块在固体培养基上置入一块活跃生长的愈组织，再在愈活跃生长的愈组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。当培养细胞长出微小纸上。当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转至细胞团以后，将其直接转至琼脂培养基上让其迅速生长琼脂培养基上让其迅速生长2 2、看护培养、看护培养 它可对单细胞进它可对单细胞进行活体连续观察。行活体连续观察。这一方法也可用这一方法也可用于原生质体培养观察于原生质体培养观察细胞壁的再生和细胞细胞壁的再生和细胞分裂过程。分裂过程。3 3、微室培养、微室培养Horsch等（等（1980）将平板培养与饲养层

32、培养技术相）将平板培养与饲养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法。结合，建立了双层滤纸植板培养方法。4 4、双层滤纸培养、双层滤纸培养 初生代谢产物初生代谢产物次生代谢产物次生代谢产物生物大分子生物大分子 三、植物细胞规模化培养体系的建立三、植物细胞规模化培养体系的建立(1）准确选择选择能产产生目的化合物的植物种类种类；(2）尽尽量选择选择自然状态状态下产产生天然产产物的组织组织器官 为为外植体；(3)高产种产种子细细胞克隆的方法：单细单细胞培养养后，将单细将单细胞扩扩增形成的愈伤组织伤组织分2份份，1份份成分含量分析，另1份份保留培养养。1 1、种子细胞的选择、种子细胞的选择2 2、

33、种子细胞系的增殖与放大培养、种子细胞系的增殖与放大培养 种子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从几百种子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从几百毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定值后，应转移毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定值后，应转移至体积较小的生物反应器培养。至体积较小的生物反应器培养。（1 1）成批培养：在一个培养体积中接种细胞或添加培养）成批培养：在一个培养体积中接种细胞或添加培养基后，中途不添加也不更换培养基的方式。基后，中途不添加也不更换培养基的方式。（2 2）连续培养：在培养过程中，不断向反应器中以一定）连续培养：在培养过程中，不断向反应器中以一定流量添加新培

34、养基，同时以一定流量从系统中取出培养基流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中取出培养基的方式。的方式。(3)(3)半连续培养：在完成成批培养的一个周期后，从反应半连续培养：在完成成批培养的一个周期后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作为下器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的方式。方式。3 3、大规模培养体系的建立、大规模培养体系的建立4 4生物反应器类型及特点生物反应器类型及特点机械搅拌式培养系统机械搅拌式培养系统 Stirred Tank Bioreactor

35、sAn external motor is used to agitate the growth medium with impellers.Sterile air or combinations of gases can be introduced(sparkling)气压搅拌式培养系统气压搅拌式培养系统Bubble Column Bioreactor(Airlift Reactor)Introduction of sterile air or pure gases is used both for agitation and oxygenationInternal Loop Airlift

36、 BioreactorTube placed inside the reactor creates internal circulation loop External Loop Airlift BioreactorCirculation through an external loop 固定化细胞反应器培养固定化细胞反应器培养空气入口空气出口固定有细胞 的筛网包埋有细胞 的颗粒培养液入口培养液出口流化床反应器 填充床反应器培养液人工种皮人工种皮人工胚乳人工胚乳体细胞胚体细胞胚胚胚 状状 体体人工胚乳人工胚乳是包埋体细胞胚的胶状介质是包埋体细胞胚的胶状介质人工种皮人工种皮是包在人工种子最外层的

37、胶质薄膜。是包在人工种子最外层的胶质薄膜。体细细胞胚是制作人工种种子的起始材料。它既它既可由外植体的表皮细细胞直接产产生，也可由愈伤组织伤组织的表层层细细胞产产生。P66三、人工种子三、人工种子 任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。人工种子的种类人工种子的种类根据包被的程度可将人工种子分为三大类：根据包被的程度可将人工种子分为三大类：裸露的或休眠的裸露的或休眠的繁殖体繁殖体人工种皮包被的人工种皮包被的繁殖体繁殖体水凝胶包被的繁水凝胶包被的繁殖体殖体人工种子研制的意义人工种

38、子研制的意义 人工种子结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播人工种子结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种，易于机械化操作；种，易于机械化操作；不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多，繁殖快、不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多，繁殖快、有利于工厂化生产；有利于工厂化生产；有利于繁殖生育周期长、自交不亲和、珍贵稀有的一些植有利于繁殖生育周期长、自交不亲和、珍贵稀有的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料物，也可大量繁殖无病毒材料;可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力；子活力；体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种

39、优势体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。在实际应用中主要有三大难题有待克服：在实际应用中主要有三大难题有待克服：1）许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚。）许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚。2）现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微）现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微生物的腐蚀。生物的腐蚀。3）人工种子的贮藏有待进一步完善。）人工种子的贮藏有待进一步完善。1.1.培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的不培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的不利因素，且具有省地省工可直接在田间播种等优点。利因素，且具有省地省工可直接在田间播种

40、等优点。2.2.在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，有利于幼苗茁壮成长，提高剂、固氮菌、杀虫剂等，有利于幼苗茁壮成长，提高作物产量。作物产量。3.3.人工种子可以工业化生产，提高农业的自动化程度。人工种子可以工业化生产，提高农业的自动化程度。4.4.用人工种子播种可以节约粮食。用人工种子播种可以节约粮食。例如，一个例如，一个12 L12 L的发酵罐在的发酵罐在20d20d内生产的胡萝卜内生产的胡萝卜胚状体，可以制成胚状体，可以制成10001000万粒人工种子，满足几千公顷万粒人工种子，满足几千公顷农田的种植需要，与天

41、然种子相比，大大节约了粮食。农田的种植需要，与天然种子相比，大大节约了粮食。5.5.一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产。程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产。人工种子技术确实有着诱人的前景：人工种子技术确实有着诱人的前景：用人工种皮包用人工种皮包被体细胞胚，被体细胞胚，可以制造人工可以制造人工种子种子 人工种皮人工种皮：海藻酸钠海藻酸钠 解决有些植物解决有些植物结子困难、发结子困难、发芽率低、繁殖芽率低、繁殖困难等问题困难等问题制作过程体细胞胚与藻酸钠混合后，滴入到硝酸钙或CaCl2中，CaC

42、l2浓度：2.0%-2.5%时间：20min-30min无菌水漂洗20min，形成人工种子（海藻酸钙凝胶）（云杉）细胞融合也称体细胞杂交，又叫无性杂交细胞融合也称体细胞杂交，又叫无性杂交，是指利用现代科，是指利用现代科学技术，分别取出两种生物的单个细胞，然后使这两种不同学技术，分别取出两种生物的单个细胞，然后使这两种不同的生物细胞在同一培养器中，用无性的人工方法促使两者互的生物细胞在同一培养器中，用无性的人工方法促使两者互相凝集并发生细胞之间的融合，进而导致基因重组，产生能相凝集并发生细胞之间的融合，进而导致基因重组，产生能同时表达两个亲本细胞有益性状的细胞杂交技术。同时表达两个亲本细胞有益性

43、状的细胞杂交技术。四、四、植物细胞融合植物细胞融合(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体植物体细细胞胞杂杂交交杂杂种种植植株株融合的融合的原生质原生质体体ABAB再再生生出出细细胞胞壁壁脱脱分分化化愈愈伤伤组组织织再再分分化化1 1、过程、过程植物细胞的融合植物细胞的融合植物组织培养植物组织培养植物细胞植物细胞A原生质体原生质体B原生质体原生质体A杂种杂种细胞细胞AB去去 壁壁去去 壁壁人人工工诱诱导导方法？方法？促进融合促进融合的方法？的方法？融合融合完成完成的的标志标志植物细胞植物细胞B去壁去壁去壁去壁纤维素酶纤维素酶果胶酶果胶酶原原生生质质体体植物细胞植物细胞原生质体融合原生质体融合

44、离心、离心、振动、振动、电刺激、电刺激、聚乙二聚乙二醇醇再生细胞壁再生细胞壁杂种细胞杂种细胞去去分分化化愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株激素激素筛选筛选等量等量激素激素再分再分化化植物体细胞杂交植物体细胞杂交(一一)原生质体的制备原生质体的制备方法：方法：取材与除菌取材与除菌酶解酶解分离分离洗涤洗涤P61P61鉴定鉴定 植物细胞壁的主要成分是纤维素，还有少量的半植物细胞壁的主要成分是纤维素，还有少量的半纤维素、果胶、蛋白质等，细胞壁的去除方法主要有纤维素、果胶、蛋白质等，细胞壁的去除方法主要有机械法和酶消化法两种方法。机械法和酶消化法两种方法。机械法机械法 首先将外植体（或愈伤组织）进行高渗溶

45、液首先将外植体（或愈伤组织）进行高渗溶液(可用盐或可用盐或糖溶液糖溶液)处理处理,结果会导致细胞脱水、质壁分离。之后再以组织结果会导致细胞脱水、质壁分离。之后再以组织捣碎机等高速机械切割细胞，从而获得脱壁细胞。该法虽然简捣碎机等高速机械切割细胞，从而获得脱壁细胞。该法虽然简单易行，但原生质体损伤严重、数量少。单易行，但原生质体损伤严重、数量少。酶法酶法 利用消化细胞壁的酶，破坏植物细胞壁，从而释放出植物利用消化细胞壁的酶，破坏植物细胞壁，从而释放出植物原生质体，这是目前应用的方法。原生质体，这是目前应用的方法。常用的酶类有：纤维素酶、果常用的酶类有：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、蜗牛酶等胶酶、

46、半纤维素酶、蜗牛酶等。通常将将在外界因素作用下，使两两个个或两个两个以上植物细细胞合并并成一个个多核细细胞的过过程称为称为植物细细胞融合，也称为称为植物体细细胞杂杂交。（二）植物原生质体融合（二）植物原生质体融合融合方法融合方法 化学诱导学诱导融合。该该法不需要贵贵重仪仪器、试剂试剂易得，一直是细细胞融合的重要方法。尤其是聚乙二醇（PEGPEG）结结合高PHPH、高钙钙法诱导诱导融合方法。按比例混合双亲双亲原生质质体滴加PEGPEG溶液，摇匀摇匀，静静置滴加高钙钙高PHPH溶液，摇匀摇匀，静静置滴加原生质质体培养养液洗涤数涤数次离心获获得原生质质体细细胞团团筛选筛选、再生杂杂合细细胞。物理诱导

47、诱导融合。显显微操作、离心、振动动等机械方法或电场电场磁刺激法等均是较为较为有效地促进细进细胞融合的方法，其中以电场电场磁刺激法用得较为较为广泛。P62P62 高高Ca和高和高PH及及 PEG结合诱导结合诱导操作流程为操作流程为:用混合盐溶液对原生质体进行融合前预处理，以及在促融剂中添加用混合盐溶液对原生质体进行融合前预处理，以及在促融剂中添加二甲基亚砜、胰蛋白酶、精胺或亚精胺，也可提高融合率二甲基亚砜、胰蛋白酶、精胺或亚精胺，也可提高融合率 植物原生质质体融合后，融合混合物在再生培养养基中长长出细细胞壁，通过过有丝丝分裂，产产生出有亲亲本细细胞、同源融合体及杂种细杂种细胞组组成的混合群体，因

48、此，需通过过培养养与筛选过与筛选过程，除去不需要的细细胞，分离出杂种细杂种细胞。筛选筛选的方法有：P63遗传遗传互补筛选补筛选法；抗性互补筛选补筛选法；利用物理特性筛选筛选法；利用生长长特性筛选筛选法。（三）（三）杂种细胞筛选与培养杂种细胞筛选与培养原生质体培养方法原生质体培养方法优势优势：打破了不同种生物间的生殖隔离限制，打破了不同种生物间的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。植物体细胞杂交植物体细胞杂交与有性杂交方法比较与有性杂交方法比较未解决的问题：未能让杂种植物按照人们未解决的问题：未能让杂种植物按照人们 的需要表现出亲代的优良。的需要

49、表现出亲代的优良。为什么为什么“番茄番茄马铃薯马铃薯”超级杂种植株没有如超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？铃薯？主要原因是：主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯所以马铃薯番茄杂番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能不能再像马铃再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达有序表达，杂交植，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。掌握以下内容：掌握以下内容：名词解释：愈伤组织、人工种子、克隆技术。名词解释：愈伤组织、人工种子、克隆技术。人工种子及其制备方法。人工种子及其制备方法。通过愈伤组织途径实现植株的快速组培。通过愈伤组织途径实现植株的快速组培。植物细胞培养方法及大规模培养方法。植物细胞培养方法及大规模培养方法。细胞融合技术及其应用。细胞融合技术及其应用。