纤维素柱填料的制备及其在超氧化物歧化酶提纯中的应用

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1、纤维素柱填料的制备及其在超氧化物歧化酶提纯中的应用朱建发 肖 静 左 涛 易 威（化学与分子科学学院 湖北 武汉 430072）摘 要 超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内一种重要的自由基清除剂猪血液里CuZn-SOD 与血红蛋白共存于红血球，用有机溶剂沉淀蛋白质，得到粗酶提取液，用纤维素铜氨溶液制 备一种成本较低，具有高分辨性能和良好物理性能的新型尺寸排除色谱，用梯度淋洗的方法 纯化 CuZn-SOD。CuZn-SOD 尺寸排除色谱 梯度淋洗一、介绍1、CuZn-SOD 及其分离纯化CuZn-SOD与血红蛋白共存予红血球中，它是一种重要的自由基清除剂，对生物有保护作用。 这类酶的发现促进了自由

2、基生物学的发展，并为人类治疗多种炎症，放射病，自身免疫疾病 及抗衰老等提供了一个具有广泛应用前景的药物1。用 CHCl3-C2H5OH 处理，使血红蛋白沉淀，CuZn-SOD留在水-乙醇相中，加磷酸氢二钾可使SOD的含水乙醇相分出，钾丙 酮使SOD沉淀，极性溶剂使蛋白质脱去水化层，降低介电常数，使蛋白质颗粒凝集沉淀。2、纤维素柱填料及生物高分子的分级排除色谱 过去的三十年中，由于纤维素膜在膜相对较低的价格，与生物化合物较好的相容性和明显的亲水性，使得其在分离中已有了广泛的商业用途2， 3。尺寸排除色谱就是使高分子流过孔径具有一定尺寸分布的色谱柱填料， 分子量大的高分子尺寸较大，进入孔隙的可能性

3、小，流经填料时间校短，反之，分子量小的 流经填料时间长。此法在生物大分子的实验室研究和工业生产中得到了越来越广泛的应用4， 5。采用 PEG2000 和纤维素铜氨溶液共混，制得了强度很好的再生纤维素改性多孔膜， 其孔径是未共混得纤维素膜的 4 倍。纤维素共混膜在不同凝固条件下可形成多孔膜，且孔径 可通过加入的水溶性高分子的种类、分子量、含量控制，在此基础上制备了系列多孔色谱柱 填料。3、梯度洗脱法 梯度洗脱的能力是逐步增加的，克服了直线洗脱中的拖尾现象，混合物中的各个组分逐个进入解吸状态，因此分辨率大大提高，形成梯度应满足：（ 1）淋洗液总体积足够大，洗 脱时间足够长，使各峰不致丢失；（2）梯

4、度的斜度要足够平，使各峰分开，但又要足够陡峭， 以免峰形过宽或拖尾；（3）梯度淋洗速度要适当，这样可利用全柱长进行无数次的解吸和再 吸附，达到分离目的；（4）最大分辨率的梯度洗脱应在那些对吸附和洗脱有相近亲和力的大 分子出现的区域比较平坦，而在毗邻大分子的亲和力差异较大的区域是陡峭的，通常要经过 反复实验，摸索出一个合适的梯度淋洗配方来调节梯度，才能达到理想结果。二、实验部分1、实验试剂和仪器试剂:CuSO45H2O,2O%NaOH,PEG-2OOO,棉短绒，4%硫酸，异丙醇，浓氨水，95% 乙醇，氯仿，K2HPO43H2O,K2HPO4,O.9%NaCl,丙酮，10mmol/LHCl,新鲜猪

5、血 500ml, 甲醛溶液。仪器： 抽滤装置， HL-2 型恒流泵， BSZ-160A 型部分自动收集器，紫外可见分 光光度计，玻璃色谱柱，低温高速离心机等。1、 纤维素柱填料的制备(1) 制备 Cu(OH)2 取 16.5g 五水硫酸铜，加蒸馏水加热溶解至沸，停止加热， 缓缓加入 2528的浓氨水溶液，并搅拌冷至室温后，用水将沉淀洗至中性， 倒出清液，加水于沉淀中冰水浴条件下加 l0NaOH 并搅拌，用水洗至中性， 抽滤得天蓝色湿 Cu(OH)2。(2) 制备纤维素铜氨溶液8g纤维素置于50g浓氨水中，加入13ml水后密封杯口， 置于冰箱中冷至10oC以下，将10.4g新制的Cu(0H)2加

6、入到6.4g10%的NaOH 里，搅拌均匀后倒入冷却的纤维素铜氨溶液里，立即搅拌均匀，置于冰箱中冷 却，冷却后加入少量水，继续搅拌，再冷却再搅拌，变为蓝色清亮粘稠液(I), 纤维素浓度约为 8%。(3) 柱填料的制备 将上步制得的纤维素铜氨溶液装入注射器中，均匀用力，推 出丝状溶液，直接在10%NaOH溶液中凝固15min,将丝状物转移到4%的稀 硫酸中，放置30min,得到透明均匀细丝，用水洗去酸，剪成1mm以下圆柱体， 保存在 20%异丙醇和2%甲醇水溶液中备用。2、酶的制备(1) 取新鲜猪血500ml，3000转/min离心20min，收集红细胞后，加入等体积0.9% NaCl溶液，充分

7、搅拌后，再次离心，弃上层清液(反复3次)，收集洗涤的红 细胞，加蒸馏水，将烧杯置于冰浴中搅拌溶血40min以上，得血溶液。(2) 往血溶液中缓慢加入在4oC下预冷过的95%C2H5OH (0.25倍体积)，然后缓缓 加入在4oC下预冷过的CHCl3 (0.15倍体积)，搅拌，室温下3000转/min离心 20min，弃去沉淀(血红蛋白)，收集上层清液约，即粗酶提取液。(3) 往上述溶液中加K2HPO43H2O(按43gK2HPO43H2O/100ml)，分液，收集上层 乙醇一氯仿相，室温下离心(3500转/min) 25min弃去沉淀，得上层清液.向上 一步所得清液中加(0.75倍)在4oC下

8、预冷过的丙酮，使CuZn-SOD沉淀下 来，室温下3500转/min离心20min收集灰白沉淀物，将其溶于少量蒸馏水中， 4oC下，在2.5mmol/L(Ph=7.6)的磷酸钾缓冲溶液中透析每30 min换一次透析液， 共换4 5次，透析内液出现沉淀，在室温下3500转/min离心，弃去沉淀，收 集上层清液。(4) 纤维素柱层析：将填料装入色谱柱使填料均匀，无气泡。装好后，填料上步用 滤纸片覆盖，填料顶部保持平整。用2.5mmol/L缓冲液作柱层析平衡液，进行 梯度洗脱。(a) 洗脱方法：用滴管将粗酶制剂沿柱内壁加到纤维素柱表面，慢慢放松活塞，使 样品液面降到柱表面，再加少许洗脱液洗涤柱壁，反

9、复两次。(b) 梯度洗脱装置图:A储液瓶；B 混合瓶；C电磁搅拌器；D, E活塞；F搅拌磁子； G色谱柱；HBSZ-160型部分自动收集器；IHL_2型恒流泵(c) 洗脱前，开动搅拌器，打开活塞D、E, B中浓度线性递增；关闭 活塞D、E，在A中加200mmol/L、Ph=7.6的磷酸钾缓冲溶液 100ml,B中加2.5mmol/LpH=7.6缓冲溶液100m 1,打开活塞D、 E,用恒流泵控制流速40ml/h,用自动部分收集器收集流出液，每 管 4ml, 共 30 管。(d) 以蒸馏水为参比，在280nm处用紫外吸收法测每管的吸光度，绘 制淋洗曲线。三、实验结果绘制出的淋洗曲线如下图所示：四

10、、讨论1、关于纤维素柱填料：从纤维素铜氨溶液制备的柱柱填料强度高、尺寸稳定性好、分辨率高，但孔径太小，分级范围窄，使用受到限制，用 PEG 2000和纤维素铜氨溶液共混，制得强度好的再生性纤维素改性多孔膜，其孔径是未共混的 4 倍，但共混时难混均匀，液体与粘稠物两相分离， 不易制得均匀的丝状物。2、关于酶的制备：CuZn-SOD与血红蛋白共存与红血球，通过离心，可除去血清，收集红细胞，用极性有机溶剂使蛋白质脱去水化层并降低介电 常数而增加带电质点间相互作用，致使蛋白质颗粒凝集而沉淀，此法要 求低温操作，并尽量缩短处理时间，避免蛋白质变性。 CuZn-SOD 的 pl=4.95,在Ph=7.6的

11、条件下带负电，通过纤维素阴离子交换柱可进一步 纯化。3、关于梯度淋洗：洗脱的梯度在柱层析中是首要因素，可根据实验要求设 计各种方法，常用的梯度混合器由两个容器构成，二者体积相等，放在 同一水平台上，一个盛起始淋洗液，另一个盛上限淋洗液，两者用管连 通，淋洗液从第一个容器流入柱时，第二个容器中的淋洗液自动补足， 使上限淋洗液浓度线性增加，改变梯度容器的相对大小和形状可产生凹 形或凸形梯度，形成梯度应满足：淋洗总体积足够大；梯度的斜度足够 平缓，使各峰分开；又要足够陡峭，以免峰变宽或拖尾；梯度升降速度 要合适；要反复实验，摸索出合适的梯度洗脱配方来调节梯度。参考文献1 余瑞元等. 北京鸭红细胞超氧

12、化物歧化酶分离纯化和性质. 北京大学 学报(自然科学版)， 1990， 26(4)： 4752 G Yang, L Zhang. J Membrance Sci, 1996(114):1491553 G Yang, L Zhang, X Xiong, et al. Chinese J Polym Sci,2001(19):4154 D Lecacheux, G Brigand. Carbohydr Polym, 1998(8):1191305 S C Dhurms. J Chromatogr A, 1996(720):1511666 武汉大学化学与分子科学学院实验中心编综合化学实验 2003 年第一 版