转录组测序 转录组转录组及转录组测序

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1、转录组测序 转录组转录组及转录组测序导读:就爱阅读网友为您分享以下“转录组转录组及转录组测序”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对92to .com的支持！第一章 转录组及转录组测序第一节 前言1953年，沃森与克里克对DNA双螺旋结构的精确描绘开创了生命科学的黄金时 代，随后如火如荼的开展起来的人类基因组计划建立起庞大复杂的基因组数据库 使人类对了解生命本源和控制生命进程燃起无限憧憬。随着越来越多的基因测序工 作渐渐完成，一本“写满生命密码的天书” 呈现在我们面前, 然而，接下来的问 题更纷扰而至:1) 这些基因有什么功能,12) 不同的基因参与了哪些细胞内不同的生命过程,3) 基因的表达是如

2、何调控的呢,4) 基因与基因产物之间是如何相互作用的呢,5) 相同的基因在不同的细胞内的表达水平有差异吗,6) 相同的基因处于疾病和治疗状态下的表达水平会有哪些改变,如何读懂这本“天书”是目前横亘在科学家们面前严峻的挑战。 因此，在人类基因组项目后，转录组学，蛋白组学，代谢组学等组学不断涌 现，生命科学研究已经跨入后基因组时代。其中，转录组学作为一个率先发展起来 的学科是研究细胞表型和功能的一个重要手段，转录组高通量测序技术开始在生物 学前沿研究中得到了广泛的应用。第二节 转录组(transcriptome)与转录组学(transcriptomics) 读懂基因组这本“天书”，最先要研究清楚基

3、因是怎么表达的。所谓基因表 达，是指将基因携带的遗传信息转变为可辨别的表型的整个过程。基因表达的第一 步, 也即基因表达调控的关键环节，是以 DNA 为模板合成 RNA 的转录过程。转录后 的所有mRNA的总称即转录组。由转录组延伸出来一门学科即转录组学，它是分子 生物学的分支，负责研究在单个细胞或一个细胞群的特定细胞类型内所产生的 mRNA分子，是从RNA层次研究基因表达的情况。第三节 转录组研究的重要性 转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的纽带，转录水平的调控 是最重要也是目前研究最广泛的生物体调控方式。转录组的研究比基因组的研究能 给出 更高效的有用信息。比如，人类基因组包含

4、有30亿个碱基对，其中大约只有 5万个基因转录成mRNA分子，而转录后的mRNA仅部分被翻译生成功能性的蛋白 质。与基因组不同，转录组更有时间空间性。比如， 我们人体大部分细胞具有一 模一样的基因， 而即使同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情 况也是不完全相同的。所以，除了异常3的 mRNA 降解现象(如转录衰减)以外，转录组反映的是特 定条件下活跃表达的 基因。同时， 蛋白质组研究需要更多的转录组研究的信息。因为单一的蛋白质组数 据不足以清楚地鉴定基因的功能，因此蛋白质组的数据也需要转录组的研究结果加 以印证。因 此， 转录组的研究可以提供什么条件下什么基因表达什么信息，从而

5、推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制。通过对转录组的研究， 科研人员还可以确 定不同种类的细胞和组织的基因在何时何地被激活或进入睡眠，对转录本的定量可以了解特定基因的活性和表达量，用于疾病的诊断和治疗， 比如与癌症相关的基因 表达量的改变可以帮助我们揭开癌症的秘密。通过对转录 组的研究，也让个性化医疗的目标，从共性转移到个性，成为可能。第四节 转录组测序真核生物的基因由三类RNA聚合酶进行转录:RNA聚合酶I和III负责种类稀 少、功能重要的看家非编码RNA基因的转录，包括rRNA，tRNA，snoRNA，snRNA 等。由这两类4RNA聚合酶转录的非编码RNA属于看家RNA,在

6、各种生理和病理状态下都被高 水平转录，转录产物占细胞内RNA总量的95%以上，不是生命科学研究前沿领域 的主要关注对象。相反地，RNA聚合酶II负责蛋白质编码基因和调控非编码RNA 的转录，在真核生物的不同生理和病理状态下表达量被严格调控，一直吸引着各生 命科学研究领域的重点关注。无比幸运的是，由RNA聚合酶II生成的转录的末端 均含有3端多聚腺苷尾【3poly（A） tail】。转录组测序一般是对用多聚胸腺嘧 啶（oligo-dT）进行亲和纯化的RNA聚合酶II转录生成的成熟mRNA和ncRNA进行 高通量测序。这样的数据有效排除了看家非编码RNA的干扰，可以通过一次测序 获得一种细胞内几乎

7、所有重要基因的表达参数。基于高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整 体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能够发现未知转 录本和稀有转录本，精确的识别可变剪接位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态 性），提供最全面的转录组信息。相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预 先 针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的 检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂 性的强大工具。随着二代测序技术的发展，测序成本大幅度降低，大规模转录组测序将成为转 录组研究的重要方法。多项研究已经表明，二代测序

8、技术的应用，能有效改善诸如 EST、SAGE、CAGE、MPSS、PET和全长cDNA测序等传统转录组研究方法的结 果，使之得到大大的提升。基于转录组高通量测序的种种技术优势，此种技术应用 范围较广，主要有转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪接研究等），转录本变 异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研 究、microRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现。第二章 高通量测序第一节 测序技术的发展 测序技术最早是在20世纪70年代，是用双脱氧终止法16 和化学降解法2-3测定多聚核糖核苷酸序列，也就是我们今天说第一代测序。双脱氧

9、核苷酸末 端终止测序法是利用ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸 二酯键的原理来中断DNA的合成反应。在反应体系中加入一定量的带有放射性同位 素标记的ddNTP，通过凝胶电泳和放射自显影技术，根据电泳带的位置确定待测分 子的DNA序列。化学降解法是用特定的化学试剂去标记碱基然后用化学方法打断待 测 序列，再用电泳方法读出序列。两者有很明显的区别:双脱氧核苷酸末端终止测 序法是利用ddNTP随机中断合成待测序列，化学降解法是用特定化学试剂标记碱 基再用化学方法降解成待测序列。由于操作放射性同位素标记在某些方面很繁琐，80年代中期，有人以荧光标记 代替了放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射自显 影 4。90年代中期，也有毛细管电泳技术的出现大大提高了测序的通量5。另 外，在这一时期，也出现了一些其他测序方法，比如焦磷酸测序法6，其 实就是后来Roche公司的454技术;还有连接酶测序法7,也就是后来ABI公司的SOLiD 技术。7 大家熟知的人类基因组测序,当时只有第一代测序,完成整个人类基因组计划花费了30 亿美元和三年时间。其成本之高,速度之慢激发了人们不断的创新,终 于有 了第二代测序技术,简称高通量测序技术。与第一代相比,没有了高成本、 慢速度,拿人类基因组计划来说,8