《蛋白质聚焦层析》PPT课件

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1、L/O/G/O蛋白质聚焦层析蛋白质聚焦层析谷春娇谷春娇马力马力任重任重王聪王聪定义定义聚焦层析是一种操作简单、廉价的聚焦层析是一种操作简单、廉价的柱层析柱层析技技术术其流动相为其流动相为多缓冲多缓冲液液，固定相为，固定相为多缓冲交换多缓冲交换剂剂利用层析过程中固定相偶联的利用层析过程中固定相偶联的具有两性解离具有两性解离功能的有机分子功能的有机分子为配基，与流动相中某些为配基，与流动相中某些两两性物质性物质发生发生等等电电聚焦反应聚焦反应而进行的一种分离而进行的一种分离方法方法等电聚焦等电聚焦 聚焦层析聚焦层析柱层析柱层析发展发展优点优点有聚焦作用，蛋白峰尖、带狭，带宽度为单位有聚焦作用，蛋白

2、峰尖、带狭，带宽度为单位在柱内自动形成在柱内自动形成pHpH梯度，不需要梯度，不需要pHpH梯度装置梯度装置 操作方便操作方便 分辨率高分辨率高4123近年来，由瑞典近年来，由瑞典Pharmacia公司设计了公司设计了一种新的分离技术，叫做聚焦层析一种新的分离技术，叫做聚焦层析(Chromatofocusing)，其产品已经实现量产以及商业化其产品已经实现量产以及商业化其优点如下：其优点如下：关键技术关键技术多缓冲液多缓冲液 多缓冲液离多缓冲液离子交换树脂子交换树脂 两种材料分别作为流动相两种材料分别作为流动相以及固定相以及固定相发展了两发展了两类新材料类新材料多缓冲液多缓冲液(Polybuf

3、fer)属于属于两性电解质两性电解质一类的缓冲液一类的缓冲液含有多种缓冲液含有多种缓冲液用用NaOH滴定的滴定曲线近似平滑的直线滴定的滴定曲线近似平滑的直线该公司有该公司有Polyboffer96和和Polybuffer74两种两种产品，即分别代表缓冲力范围为产品，即分别代表缓冲力范围为pH9-6和和pH7-4多缓冲液离子交换树脂多缓冲液离子交换树脂(polybufferexehangers)带有碱性缓冲基团的带有碱性缓冲基团的阴离子交换树脂阴离子交换树脂把带电基团通过醚键与把带电基团通过醚键与Sepharose 6B的单的单糖连接的糖连接的也有两种产品：也有两种产品：PBE94、PBE118

4、应用范围应用范围分别是分别是pH9-4和和pH11-8但后者要与两性电解质但后者要与两性电解质Pharmalyte（）（）联合联合使用使用 原理原理PH梯度溶梯度溶液的形成液的形成 蛋白质的行蛋白质的行为为 聚焦效应聚焦效应 pH梯度溶液的形成梯度溶液的形成 聚焦层析介质上偶联的聚焦层析介质上偶联的多氨基多羧基的有多氨基多羧基的有机分子机分子，具有相应的酸性和碱性离子交换，具有相应的酸性和碱性离子交换基团基团这些基团本身所带的正负电荷与这些基团本身所带的正负电荷与缓冲液中缓冲液中的氢离子和氢氧根离子的氢离子和氢氧根离子作用而形成的作用而形成的pH梯度梯度在层析过程中能与溶液中某些阴离子或阳离在

5、层析过程中能与溶液中某些阴离子或阳离子发生聚焦反应，聚焦在不同区域，使物质子发生聚焦反应，聚焦在不同区域，使物质得到分离。得到分离。pH梯度溶液的形成梯度溶液的形成 例如，当柱中装阴离子交换剂例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94（作固（作固定相）时，先用定相）时，先用起始缓冲液起始缓冲液平衡到平衡到pH9，再用含再用含pH6的多缓冲剂物质（作流动相）的的多缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体淋洗液通过柱体这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用子交换对结合发生中和作用随着淋洗液的不断加人，柱内每点的随着淋洗液的不断加人，柱内每点的p

6、H值从值从高到低逐渐下降高到低逐渐下降照此处理一段时间，从层析柱顶部到底部就照此处理一段时间，从层析柱顶部到底部就形成了形成了pH6-9的梯度。的梯度。pH梯度溶液的形成梯度溶液的形成 但是随着淋洗的进行，但是随着淋洗的进行，pH梯度会逐渐梯度会逐渐向下迁移，从向下迁移，从底部流出液底部流出液的的pH却由却由9逐逐渐降至渐降至6，并最后恒定于此值，这时层，并最后恒定于此值，这时层析柱的析柱的pH梯度也就消失了梯度也就消失了蛋白质的行为蛋白质的行为蛋白质所带电荷取决于它的等电点（蛋白质所带电荷取决于它的等电点（pI）和）和层析柱中的层析柱中的pH值值当柱中的当柱中的pH低于蛋白质的低于蛋白质的p

7、I时，蛋白质带时，蛋白质带正正电荷电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的脱剂向前移动，固定相中的pH值是随着淋洗值是随着淋洗时间延长而变化的时间延长而变化的当蛋白质移动至环境当蛋白质移动至环境pH高于其高于其pI时，蛋白质时，蛋白质由带由带正电荷变为带负电荷正电荷变为带负电荷，并与阴离子交，并与阴离子交换剂结合换剂结合 蛋白质的行为蛋白质的行为由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境pH 再次低于再次低于pI时，它又带正电荷，并从交换剂时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来解吸下来随着洗脱液向柱底的迁移，随着洗

8、脱液向柱底的迁移，上述过程将反复上述过程将反复进行进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的洗下来，从而达到了分离的目的不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的洗脱出来的先后次序是按等电点排列的先后次序是按等电点排列的聚焦效应聚焦效应蛋白质按其等电点在蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列梯度环境中进行排列的过程叫做的过程叫做聚焦效应聚焦效应pH梯度的形成是聚焦效应的梯度的形成是聚焦效应的先决条件先决条件如果一种蛋

9、白质是加到已形成如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速地迁移到与它等电点相同的地迁移到与它等电点相同的pH处处从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出时被洗出 聚焦效应聚焦效应若在此蛋白质样品被洗出前，再加人第二份若在此蛋白质样品被洗出前，再加人第二份同种同种蛋白质样品时，后者将在洗脱液的作用蛋白质样品时，后者将在洗脱液的作用下以下以同样的速度同样的速度向前移动，而向前移动，而不被固定相吸不被固定相吸附附

10、，直到其迁移至近似本身等电点的环境处，直到其迁移至近似本身等电点的环境处（即第一个样品的缓慢迁移处）（即第一个样品的缓慢迁移处）然后两份样品以同样的速度迁移，最后然后两份样品以同样的速度迁移，最后同时同时从柱底洗出从柱底洗出聚焦层析的介质聚焦层析的介质大多数都是以大多数都是以交联的琼脂糖凝胶交联的琼脂糖凝胶为载体，通为载体，通过过共价键结合共价键结合将将多氨基多羧基化合物多氨基多羧基化合物偶联到偶联到琼脂糖凝胶载体上琼脂糖凝胶载体上目前用的较多的层析介质是多聚缓冲液交换目前用的较多的层析介质是多聚缓冲液交换剂（固定相）剂（固定相）PBE118，PBE94，前者属于，前者属于偏碱性层析介质（偏碱

11、性层析介质（pH 8-11），后者属于中），后者属于中性层析介质（性层析介质（pH4-9）常用多缓冲剂（流动相）有常用多缓冲剂（流动相）有Polybuffer96和和Polybuffer74（分别在分别在pH6-9和和pH7-4范围范围内有较强缓冲能力内有较强缓冲能力如将他们混合在一起，则较强缓冲能力的如将他们混合在一起，则较强缓冲能力的pH范围为范围为4-9缓冲液和交换树脂的选择缓冲液和交换树脂的选择 缓冲液和多缓冲液交换树脂每次最大操作范缓冲液和多缓冲液交换树脂每次最大操作范围是围是3pH单位单位 若是样品的若是样品的pl是已知的，只要选择对应的是已知的，只要选择对应的pH缓冲液和树脂即可

12、，最好洗脱位置在缓冲液和树脂即可，最好洗脱位置在pH梯度梯度的的1/3-1/2以后以后 若是未知样品，应先定出若是未知样品，应先定出pl值。也可用公司值。也可用公司配套提供的聚焦层析试剂箱测定配套提供的聚焦层析试剂箱测定pI 一旦决定了一旦决定了pl，就可选择了，就可选择了缓冲液和交换树脂的选择缓冲液和交换树脂的选择 交换树脂量的选择是取决于样品数量，样品交换树脂量的选择是取决于样品数量，样品性质和杂质多少等，一般性质和杂质多少等，一般2030毫升床体积毫升床体积可分离可分离1-200毫克蛋白毫克蛋白/pH单位单位操作操作 先将悬浮的多缓冲液交换树脂装柱。要求无先将悬浮的多缓冲液交换树脂装柱。

13、要求无气泡气泡(可先脱气可先脱气)用一个用一个高于多缓冲液高于多缓冲液pH的起始缓冲液平衡柱的起始缓冲液平衡柱子。当流出液子。当流出液pH与起始缓冲液与起始缓冲液pH相同即可相同即可上样上样 样品溶在所选择的多缓冲液中，再用同样的样品溶在所选择的多缓冲液中，再用同样的多缓冲液洗脱。这祥各种蛋白多缓冲液洗脱。这祥各种蛋白在自己的在自己的pl处处聚焦聚焦，并依次洗脱下来，分部收集，并依次洗脱下来，分部收集操作操作 操作流程：操作流程：聚焦层析柱聚焦层析柱 起始缓冲液平衡起始缓冲液平衡 样液样液上样上样 多缓冲液淋洗多缓冲液淋洗 洗脱液解吸附洗脱液解吸附注意事项注意事项 样品的基本性质样品的基本性质

14、 在聚焦层析前，样品最好能提供一些必要在聚焦层析前，样品最好能提供一些必要的参数，如：的参数，如：等电点、溶解度、稳定性等电点、溶解度、稳定性等等 样品制备要求样品制备要求 样品中不能含有样品中不能含有盐或强离子型盐或强离子型有机化合物，有机化合物，盐类等强电解质物质会盐类等强电解质物质会影响聚焦效应影响聚焦效应蛋白质与多缓冲液的分离蛋白质与多缓冲液的分离 一般多缓冲液不干扰酶的测活或氨基酸分析一般多缓冲液不干扰酶的测活或氨基酸分析 虽然多缓冲液不影响虽然多缓冲液不影响考马斯考马斯亮亮兰反应兰反应，但与，但与铜离子会形成复合物，所以干扰铜离子会形成复合物，所以干扰Lowry反应反应 如用如用L

15、owry反应测蛋白有必要将蛋白与多缓反应测蛋白有必要将蛋白与多缓冲液分开。这时用冲液分开。这时用硫酸铵沉淀法，凝胶过滤硫酸铵沉淀法，凝胶过滤法或亲和层析法法或亲和层析法等都可以将蛋白与多缓冲液等都可以将蛋白与多缓冲液分开。分开。再生再生 多缓冲液交换树脂的再生很容易，只要用多缓冲液交换树脂的再生很容易，只要用2-3倍床体积的倍床体积的1MNaCl在柱内洗涤就行了在柱内洗涤就行了 如果有强结合力的蛋白未除去，可用洗涤，如果有强结合力的蛋白未除去，可用洗涤，但要立刻用高但要立刻用高pH溶液洗去溶液洗去HCI，再用所选择，再用所选择的起始缓冲液平衡后，即可使用的起始缓冲液平衡后，即可使用 应用简介应

16、用简介聚焦层析最适合于分离某些蛋白质聚焦层析最适合于分离某些蛋白质分子量和极性方面的性分子量和极性方面的性质十分相似，而等电点有区别质十分相似，而等电点有区别的物质。尤其对用其他的层的物质。尤其对用其他的层析方法难以分离的混合物，采用此法可得到较好的效果析方法难以分离的混合物，采用此法可得到较好的效果123人血清载脂蛋白人血清载脂蛋白C亚型的分离亚型的分离 华西医科大学基础医学院方定志等利用此方华西医科大学基础医学院方定志等利用此方法分离了人血清载脂蛋白法分离了人血清载脂蛋白C亚型亚型 他们用密度梯度超速离心法他们用密度梯度超速离心法,从混合人血清中从混合人血清中分离极低密度脂蛋白，经脱脂后再

17、进行聚焦分离极低密度脂蛋白，经脱脂后再进行聚焦层析分离其中的载脂蛋白。获得的纯品载脂层析分离其中的载脂蛋白。获得的纯品载脂蛋白蛋白C1和和C2经等电聚焦电泳均呈现一经等电聚焦电泳均呈现一条带条带具体操作具体操作 将将 1 0 0 m l P B E 9 4 混 悬 于混 悬 于 1 0 0 m l 平 衡 缓 冲 液平 衡 缓 冲 液(25mmol/L咪唑尿素咪唑尿素,1mmol/L Na2EDTA,pH7.4)装装入入1.5cm75cm层析柱层析柱 于于4用用10倍床体积平衡缓冲液平衡后倍床体积平衡缓冲液平衡后,用溶解的用溶解的apoVLDL(含蛋白含蛋白4550mg)上柱上柱 然 后 于然

18、 后 于 4 用用 1 0 0 0 m l 洗 脱 缓 冲 液洗 脱 缓 冲 液(polybuffer74 8mol/L尿素为尿素为1 8，pH4.0)洗脱洗脱,形成形成pH梯度梯度 洗脱速度为洗脱速度为2025ml/min，每管分部收集，每管分部收集 测定各管测定各管280nm紫外光吸收值紫外光吸收值,收集各蛋白峰收集各蛋白峰 经经HTP柱层析除去柱层析除去polybuffer，最后对标准透析缓，最后对标准透析缓冲液冲液(20mmol/L Tris-HCl,0.85%NaCl,0.01%Na2EDTA,0.01%NaN3,pH7.4)于于4透析透析 洗脱曲线洗脱曲线昆虫谷胱甘肽昆虫谷胱甘肽S

19、-转移酶的分离转移酶的分离 北京大学生命科学学院的周先碗在分离纯化北京大学生命科学学院的周先碗在分离纯化昆虫谷胱甘肽昆虫谷胱甘肽S-转移酶过程中也用到了聚焦转移酶过程中也用到了聚焦层析层析具体操作具体操作 首先将冷冻的蜡螟幼虫在磷酸缓冲液中匀桨首先将冷冻的蜡螟幼虫在磷酸缓冲液中匀桨,经经10 000 g和和100 000 g分级离心分级离心 取上清液通过取上清液通过QAE-Sephadex A-25离子交换柱层析离子交换柱层析除去部分色素和杂蛋白除去部分色素和杂蛋白 然后采用谷胱甘肽然后采用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶亲和层析琼脂糖凝胶亲和层析(GSH-QT4),四溴酚酞二磺酸盐四溴酚酞二磺酸盐-琼脂

20、糖凝胶亲和层析琼脂糖凝胶亲和层析(BSP-QT4),铜离子铜离子-琼脂糖凝胶螯合层析琼脂糖凝胶螯合层析(Cu2+-QT4)及及PBE94-Sepharose(PBE94)聚焦层析等层析技术进一步分聚焦层析等层析技术进一步分离纯化离纯化 将上述方法获得的色谱峰以将上述方法获得的色谱峰以CDNB和和DCNB为底物为底物检测生物活性检测生物活性 具有生物活性部分的蛋白质具有生物活性部分的蛋白质,通过通过SDS-PAGE测定其测定其分子量分子量 洗脱曲线洗脱曲线-乳球蛋白乳球蛋白A型和型和B型的分离型的分离 美国一所大学应用阳离子型聚焦层析美国一所大学应用阳离子型聚焦层析分离分离A型和型和B型型-乳球蛋白乳球蛋白 A型和型和B型分子量都是型分子量都是36000，等电点，等电点仅差仅差 A型等电点为型为型等电点为型为-乳球蛋白乳球蛋白A型和型和B型的分离型的分离 PolyCAT A柱，上样量为的柱，上样量为的-乳球蛋乳球蛋白白 预饱和缓冲液由预饱和缓冲液由10mM柠檬酸组成，柠檬酸组成，用用NaOH滴定到。滴定到。洗脱液，流速为，即可达到两者的分洗脱液，流速为，即可达到两者的分离离 13分钟时得到的是分钟时得到的是-乳球蛋白乳球蛋白A，16分钟是分钟是-乳球蛋白乳球蛋白B洗脱曲线洗脱曲线L/O/G/OThank You!