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1、二、目的基因的获取二、目的基因的获取直接从染色体直接从染色体DNA中分离中分离聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymease Chain Reaction(PCR)Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异是体外酶促合成特异DNADNA片段的一种方法片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期应组成一个周期,循环进行循环进行,使目的使目的DNADNA得以迅得以迅速扩增速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。省时等特点。PCR 可以把可以把 放大放大染色
2、体染色体PCR 基因放大基因放大连琐连琐反反应应2 2、PCRPCR的基本原理的基本原理n试管中进行的DNA复制反应，依据nDNA半保留复制的机理；n体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；n通过人为控制体外合成系统的温度，使n双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，nDNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。n1）、预变性：使模板DNA的二级结构充分打开，让DNA双链充分解离,为了第一次退火过程时候引物可以尽量多的结合到模板上面。n一般的PCR反应的预变性温度是94或95，预变性时间一般设为3-5 min。n2）、变性：使DNA双链解离变为单链。一般9495，1min
3、足以使模板变性n若低于94则需延长时间n但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。n3)、退火(复性)：使引物结合在模板上。退火温度是影响PCR特异性的重要因素。n退火温度，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，一般在40-65 之间。n对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度的计算公式引物的复性温度的计算公式nTm（解链温度）4(G+C)+2(A+T)n复性温度=Tm值（510）；在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性；n复性时间一般为3060s，足以
4、使引物与模板之间完全结合。4 4、PCRPCR的反应过程演示的反应过程演示5 5、PCRPCR法克隆基因的技术流程法克隆基因的技术流程设计引物设计引物提取基因组DNA进行电泳检测进行进行PCRPCR反应反应引物设计的原则：n（1）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。n（2）引物长度以15-40 bp为宜。n（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。n（4）引物内部避免形成二级结构。n（5）两引物间避免有互补序列。n（6）引物 3端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰），5端无严格限制。n（7）引物5端可修饰 引物5端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异性影响不大；引物5端碱基可不与
5、模板DNA互补而呈游离状态；引物5端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记3553355.2 5.2 提取基因组提取基因组DNADNA模板DNA的来源：n微生物中提取DNAn植物中提取DNAn从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化模板DNA的浓度：2ug/100ul体系nPCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高n模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加5、3 进行进行PCR反应反应5 5、4 PCR4 PCR反应体系与流程反应体系与流程反应体系反应体系n模板（模板（DNADNA或或RNARNA）n引物引物nTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶n1010PCRPCR缓冲液缓冲液n4 mM Mg4 mM Mg2+2+n0.2 mM dNTP0.2 mM dNTP反应流程反应流程n预变性预变性n变性变性n退火退火 n延伸完全延伸完全n终止终止5 5、5 5进行电泳检测进行电泳检测n电泳检测：电泳检测：对对PCR的结果进行琼脂糖凝胶的结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。（例如下面是电泳检测。（例如下面是VvSUC11基因的电泳基因的电泳结果）结果）
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