北大医学研究生课程-分子免疫学-细胞因子和细胞因子受体-王璐教授

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1、细胞因子和细胞因子受体Cytokine and Cytokine Receptor 北京大学人类疾病基因研究中心 王 露 细胞因子概念 细胞因子（细胞因子（CytokineCytokine）是指由机体各种细）是指由机体各种细胞分泌的具有调控细胞生长、分化、调节胞分泌的具有调控细胞生长、分化、调节免疫功能和生理反应并参与病理反应的小免疫功能和生理反应并参与病理反应的小分子蛋白质。分子蛋白质。细胞因子从细胞中释放出来成为重要的可溶性信使蛋白，它是细胞间信号网络的组成部分。在免疫系统，这一网络调控天然免疫和特异性免疫应答中各种功能性事件，如炎症反应、防御病毒感染、特异性T、B细胞增殖及功能调节。细胞

2、因子研究历史 1957年，发现干扰素（IFN）1969年，提出淋巴因子（lymphokine）的概念 1974年，定名细胞因子（cytokine）近年来，细胞因子发展迅猛，现已发现200多种细胞因子，成立专门的细胞因子学会，如国际细胞因子学会（international cytokine society）；创办研究细胞因子的专门杂志，如Cytokine等。人类基因组研究显示，不仅有新成员存在于已有的细胞因子家族中，还会找到全新的家族，尚有多种细胞因子有待发现。怎样确定一种物质是细胞因子？从人类基因组发现新细胞因子由于体内含量较高的细胞因子大部分已被克隆化，传统的路线已经难以发现新免疫分子。目前

3、的新细胞因子克隆化策略主要利用反向生物学原理，从人类基因组发现新细胞因子或其受体编码基因。传统生物学策略发现生物活性鉴定细胞因子蛋白克隆基因细胞表型动物模型人体内功能及与疾病关联 反向生物学策略数据库DNA序列 生物信息学蛋白质表达细胞表型动物模型人体内功能及与疾病关联。细胞因子序列同源性分析和基因Cluster分析IL-19202327303335,IL-17 B-F(包括IL-25)，IL-1 F5-F10 免疫细胞基因和蛋白表达谱分析（IL-21222628A/B29313234）免疫相关疾病的易感基因或致病基因分析(IL-24)利用免疫细胞筛选模型，开展基因表达文库或RNAi文库的功能

4、筛选新的细胞因子的发现免疫细胞免疫细胞筛选技术筛选技术生物信息学生物信息学基因芯片基因芯片酵母双酵母双杂交杂交蛋白质蛋白质组学组学结构基因结构基因组学组学动物体内动物体内实验实验基因敲除基因敲除转基因小鼠转基因小鼠功能研究功能研究药物开发药物开发研究研究其它应用其它应用研究研究免疫细胞筛选技术在发现细胞分子研究的重要位置免疫细胞筛选技术在发现细胞分子研究的重要位置筛选潜在的细胞因子的策略 未知蛋白的生物信息学分析：未知蛋白的生物信息学分析：无功能性文章报道或无免疫相关的功能性报道无功能性文章报道或无免疫相关的功能性报道具有潜在的信号肽或被证实为分泌蛋白具有潜在的信号肽或被证实为分泌蛋白蛋白氨基

5、酸数目少于蛋白氨基酸数目少于300300个个主要在免疫系统和造血系统中表达主要在免疫系统和造血系统中表达7获得的基因，获得的基因，ORFORF克隆连接在真核表达载体克隆连接在真核表达载体转染转染293T293T细胞，检测其分泌表达细胞，检测其分泌表达Th1Th2Th17TregCD4+CD45RA+nave T cellsPBMCAnti-CD3,anti-CD28,IL-1b,IL-6,TNF-a,IL-23,anti-IFN-,anti-IL-4Anti-CD3,anti-CD28,IL-12,IL-2,anti-IL-4Anti-CD3,anti-CD28,IL-4,IL-2,anti-

6、IFN-,anti-IL-10Anti-CD3,anti-CD28,IL-2,TGF-IFN-T-betIL4,IL-5,IL-13GATA-3IL-17A,IL-17F,IL-22,IL-26RORtCD25FoxP3Differentiation indexProliferation indexApoptosis index3HThymidine incorporation assay、BrdU、CFSEAnnexin VExpression profile of novel geneAdd the secreted protein在免疫细胞中，检测其生物学功能在免疫细胞中，检测其生物学功

7、能 正常细胞：正常细胞：未活化时，产生很少；未活化时，产生很少；活化后，产量可提高成百上千倍；如活化的淋巴细活化后，产量可提高成百上千倍；如活化的淋巴细胞、活化的单核胞、活化的单核/巨噬细胞、巨噬细胞、NKNK细胞、成纤维细胞、细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等。上皮细胞、内皮细胞等。IL-1IL-1、IL-6IL-6、IL-12IL-12、IL-18 IL-18 和和 TNFTNF主要由巨噬细胞产生的细胞因主要由巨噬细胞产生的细胞因子子细胞因子的来源 肿瘤细胞肿瘤细胞 如如JurkatJurkat细胞细胞(IL-2,3)(IL-2,3)、骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞(IL-6)(IL-6)、W

8、EHI-3(IL-3)WEHI-3(IL-3)等。等。基因工程技术基因工程技术 从工程细胞如大肠杆菌、酵母菌等产生重组细从工程细胞如大肠杆菌、酵母菌等产生重组细胞因子。胞因子。细胞因子的分类根据产生细胞因子的细胞种类分类：1、淋巴因子(lymphokines)2、单核因子(monokines)3、非淋巴因子、非单核因子/巨噬细胞产生的细胞因子：基质、血管内皮、成纤维细胞等根据细胞因子的结构和功能分类1 1、白细胞介素、白细胞介素(Interleukin,IL)(Interleukin,IL)2 2、集落刺激因子、集落刺激因子(Colony-Stimulating Factor,(Colony-

9、Stimulating Factor,CSF)CSF)3 3、干扰素、干扰素(Interferon,IFN)(Interferon,IFN)4 4、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子(Tumor-Necrosis Factor,TNF)(Tumor-Necrosis Factor,TNF)5 5、趋化因子、趋化因子(Chemokine,CK)(Chemokine,CK)6 6、生长因子、生长因子(Growth Factor,GF)(Growth Factor,GF)7 7、转化生长因子家族（、转化生长因子家族（TGF-b)TGF-b)1.白细胞介素(Interleukin,IL)1979年第二届国际淋

10、巴因子专题讨论会上命名的，将由白细胞产生的又在白细胞之间发挥作用的细胞因子统一命名为白细胞介素，正式命名的有IL-1-IL-35。Interleukin 来自inter-leukin，意指白细胞之间信使分子，中文译为白细胞介素。白细胞介素的分类 IL-1 家族：家族：IL-1/1Ra 18 33 IL-2 家族：家族：IL-2 4 7 9 15 21(共用共用受体链受体链)IL-6 家族家族IL-6 11 27 30 31(共用共用gp130受体链受体链)IL-10 家族家族IL-10 19 20 22 24 26 28A/B 29(结构相似结构相似)IL-12 家族家族 IL-12 23 2

11、7 35(均为异源二聚体结构均为异源二聚体结构)IL-17家族：家族：IL-17A、B、C、D、E和和F1。集落刺激因子集落刺激因子 IL-3 1 5 6 11 IL-8（趋化因子）（趋化因子）其它其它IL：IL-13 14 16 32 34传统生物学策略传统生物学策略生物活性生物活性蛋白质蛋白质基因基因细胞细胞动物模型动物模型人体内功能及与疾病关联人体内功能及与疾病关联分离纯化分离纯化cDNA克隆克隆检测表型检测表型构建构建临床相关临床相关反向生物学策略反向生物学策略DNA蛋白质蛋白质细胞细胞动物模型动物模型人体内功能及与疾病关联人体内功能及与疾病关联表达纯化表达纯化检测表型检测表型构建构建

12、临床相关临床相关疾病标本疾病标本DNA致病基因或致病基因或易感基因分析易感基因分析 IL-2 19761976发现发现,1979,1979年命名年命名,1983,1983年克隆成功年克隆成功 19651965年发现混合白细胞培养上清中存在一种可溶性因子，年发现混合白细胞培养上清中存在一种可溶性因子，可促进细胞生长，命名为母细胞形成因子可促进细胞生长，命名为母细胞形成因子（Blastogenic Factor，BF)19761976年发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞年发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，故称为生长的因子，故称为T T细胞生长因子细胞生长因子（T c

13、ell growth factor，TCGF）19791979年统一命名为白细胞介素年统一命名为白细胞介素2 2（interleukin 2，IL-2）IL-2别名 BF(blastogenic factor);Costimulator;EDF(eosinophil differentiation factor);KHF(killer cell helper factor);LMF(lymphocyte mitogenic factor);LCM factor(lymphocyte-conditioned medium factor)LPF(lymphocyte proliferation f

14、actor);MAF-C I(macrophage-activating factor for cytotoxicity I);PFC-EA(plaque forming cell enhancing factor);SCIF(secondary cytotoxic T-cell inducing factor);TCGF(T-cell growth factor);TCPA(T colony-promoting activity);TDF(thymocyte differentiation factor);TMF(thymocyte mitogenic factor);TMF(T-cell

15、maturation factor);TMF(T-cell mitogenic factor);TRF-3(T-cell replacing factor-3);TSF(thymocyte stimulating factor).19831983年年TaniguchiTaniguchi从从ConAConA刺激的刺激的JurkatJurkat白血病白血病T T细细胞中克隆成功胞中克隆成功IL-2IL-2含有含有133aa133aa，分子量为，分子量为15.5kDa15.5kDaN N端有糖基化修饰端有糖基化修饰三个半胱氨酸：三个半胱氨酸：5858、105105、125125位位 IL-2主要产生

16、细胞：主要产生细胞：主要由活化主要由活化CD4+Th1分泌分泌,CD8+T和和NK也能产生也能产生T T细胞肿瘤细胞系细胞肿瘤细胞系:如人如人Jurkat和小鼠和小鼠EL-4T T淋巴细胞杂交瘤淋巴细胞杂交瘤:FS6-14.13、HT-24A等等 IL-2受体：受体：CD25()；CDl22()；CDl32(c)IL-2的生物学活性 作用具有沿种系谱向上有约束性，向下无约束性：作用具有沿种系谱向上有约束性，向下无约束性：1 1、促进活化的、促进活化的T T细胞进入细胞进入S S期，维持细胞的增殖，刺激产生：期，维持细胞的增殖，刺激产生：MHCIIMHCII，IFN-IFN-，IL-4IL-4、

17、5 5、6 6，LT-LT-，CSFCSF。2 2、促进杀伤细胞分化和效应：、促进杀伤细胞分化和效应：CTLCTL，NKNK，LAKLAK；诱导杀伤细胞：诱导杀伤细胞：IFN-IFN-，TNF-TNF-产生，增强产生，增强CTLCTL穿孔素表达穿孔素表达3 3、直接、间接作用于、直接、间接作用于B B细胞细胞：促进增殖分化，：促进增殖分化，IgIg分泌分泌4 4、促进巨噬细胞通过、促进巨噬细胞通过ADCCADCC机制杀伤肿瘤机制杀伤肿瘤IL-2主要生物学活性主要生物学活性 白细胞介素白细胞介素2 2超家族超家族:one important family of type I cytokines

18、is the common cytokine receptor chain(c)family,which consists of IL 2,IL 4,IL 7,IL 9,IL 15 and IL 21,and is so named because the receptors for these cytokines share c(also known as IL 2Rand CD132)Yrina Rochman et al.Nature Immunology.2009.9：480-4902.集落刺激因子(Colony-Stimulating Factor,CSF)能够刺激多能造血干细胞和不

19、同发育阶段的造血祖细胞增殖能够刺激多能造血干细胞和不同发育阶段的造血祖细胞增殖分化，并在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。分化，并在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。根据刺激不同造血细胞系或不同分化阶段的细胞有不同的命名根据刺激不同造血细胞系或不同分化阶段的细胞有不同的命名 名名 称称 主主 要要 产产 生生 细细 胞胞 作作 用用 SCF（干干 细细 胞胞 因因 子子）纤纤 维维 母母 细细 胞胞，肝肝 细细 胞胞，内内 皮皮 细细 胞胞，上上 皮皮 细细 胞胞，基基 质质 细细 胞胞 所所 有有 类类 型型 的的 造造 血血 干干 细细 胞胞，黑黑 色色 素素 细细 胞胞，

20、肥肥 大大 细细 胞胞 IL-3（多多 重重 集集 落落 刺刺 激激 因因 子子）T T细细 胞胞 中中 性性 粒粒 细细 胞胞，单单 核核 细细 胞胞，红红 细细 胞胞，嗜嗜 碱碱 性性 粒粒 细细 胞胞 IL-5 T T细细 胞胞 嗜嗜 酸酸 性性 粒粒 细细 胞胞 IL-11 基基 质质 细细 胞胞，纤纤 维维 母母 细细 胞胞 所所 有有 类类 型型 的的 造造 血血 干干 细细 胞胞，血血 小小 板板 GM-CSF(粒粒 细细胞胞 巨巨 噬噬细细 胞胞 集集落落 刺刺 激激 因因 子子)T T细细 胞胞，单单 核核 细细 胞胞，内内 皮皮 细细 胞胞，纤纤 维维 母母 细细 胞胞 中

21、中 性性 粒粒 细细 胞胞，单单 核核 细细 胞胞，嗜嗜 酸酸 性性 粒粒 细细 胞胞，树树 突突 细细 胞胞 G-CSF（粒粒细细胞胞集集落落刺刺激激因因子子）单单 核核 细细 胞胞，纤纤 维维 母母 细细 胞胞，中中 性性 粒粒 细细 胞胞 M-CSF（巨巨 噬噬 细细 胞胞 激激 落落 刺刺 激激 因因子子）单单 核核 细细 胞胞，淋淋 巴巴 细细 胞胞，纤纤 维维 母母 细细 胞胞，内内 皮皮 细细 胞胞，上上 皮皮 细细 胞胞 单单 核核 细细 胞胞，胎胎 盘盘 滋滋 养养 细细 胞胞 EPO（红红 细细 胞胞 生生 成成 素素）肾肾 脏脏 细细 胞胞 红红 细细 胞胞 TPO（血血

22、 小小 板板 生生 成成 素素）肾肾，肝肝 血血 小小 板板 G-CSF(粒细胞集落刺激因子)1983年命名,1986年克隆成功.人G-CSF基因位于17号染色体,人类有两种不同的G-CSF DNA,分别编码含207和204个氨基酸的前体蛋白,均有30个氨基酸的先导序列,除了在35位插入了3个氨基酸外,其余序列相同.有5个半胱氨酸36=42,64=74,17游离.来源 多种细胞可产生内毒素、TNF-、IL-1、IFN-活化单核/巨噬细胞可产生，刺激成纤维、内皮细胞也可产生，某些肿瘤细胞可产生 生物学活性 主要作用于中性粒细胞谱系造血细胞的增殖、分化和活化 对人粒细胞、单核细胞、成纤维、平滑肌细

23、胞等有趋化作用。G-CSF与临床1、粒细胞减少症2、肿瘤化疗引起血细胞减少症3、贫血和骨髓发育异常综合症 3.干扰素(Interferon,IFN)具有干扰病毒感染和复制功能的细胞因子。1957年从病毒感染细胞培养中分离到一种生物活性物质，因它可以干扰其它病毒的复制而被命名为干扰素。干扰素的命名 2020世纪世纪6060年代根据来源及对酸的耐受程度，将干扰素分成年代根据来源及对酸的耐受程度，将干扰素分成I I 和和 IIII型；型；I I型型(IFN-(IFN-，IFN-)IFN-)耐酸，耐酸，pH2pH2活性稳定，其中白细胞产生的称白活性稳定，其中白细胞产生的称白细胞干扰素，成纤维细胞产生的

24、称成纤维干扰素；细胞干扰素，成纤维细胞产生的称成纤维干扰素；IIII型型(IFN-)(IFN-)不耐酸，是抗原或有丝分裂原刺激不耐酸，是抗原或有丝分裂原刺激PBMCPBMC产生又叫免疫产生又叫免疫干扰素；干扰素；8080年代又将其称为年代又将其称为IFN-IFN-，IFN-IFN-，IFN-IFN-；IFN-IFN-是异质性的，包括是异质性的，包括1414个亚型，编码基因成串排列在个亚型，编码基因成串排列在9p239p23，产物高度同源。，产物高度同源。IFN-IFN-、IFN-IFN-均定位均定位9 9号染色体，单外显子；号染色体，单外显子；许多刺激剂可活化基因表达；许多刺激剂可活化基因表达

25、；IFN-IFN-、IFN-IFN-分子结构有相似之处；分子结构有相似之处；成熟的成熟的IFN-IFN-各亚型有各亚型有166166个氨基酸个氨基酸(IFN-2 165(IFN-2 165个个),),高高度同源度同源,4,4个保守的半胱氨酸。个保守的半胱氨酸。成熟的成熟的IFN-IFN-有有166166个氨基酸个氨基酸,3,3个半胱氨酸个半胱氨酸 成熟的成熟的IFN-IFN-由由143143个氨基酸组成，以同源双体形式存在，个氨基酸组成，以同源双体形式存在，对酸不稳定。对酸不稳定。生物学活性 IFN-IFN-和和IFN-IFN-1 1、抗病毒活性：诱导抗病毒蛋白：、抗病毒活性：诱导抗病毒蛋白：

26、2-5A2-5A合成酶合成酶-催化寡核苷酸催化寡核苷酸PPP-PPP-活化活化RNaseL-RNaseL-降解病毒降解病毒RNARNA；蛋白激酶蛋白激酶PKR-PKR-肽起始因子肽起始因子eIF2eIF2磷酸化而灭活，抑制病毒蛋白的合成。磷酸化而灭活，抑制病毒蛋白的合成。2 2、抗细胞增殖：与抗病毒蛋白合成的机制相似、抗细胞增殖：与抗病毒蛋白合成的机制相似;3 3、免疫调节：上调巨噬细胞、免疫调节：上调巨噬细胞IgGFcIgGFc受体促进受体促进ADCCADCC；活化；活化NKNK，促进杀伤；，促进杀伤；诱导诱导MHCIMHCI、IIII类分子表达，增强免疫应答水平。有抗病毒、抗肿瘤的活性，但

27、类分子表达，增强免疫应答水平。有抗病毒、抗肿瘤的活性，但免疫调节的作用比免疫调节的作用比IFN-/IFN-/重要的多，有较严格的种属特异性。重要的多，有较严格的种属特异性。IFN-IFN-1 1、上调、上调MHCIMHCI类、类、IIII类分子的表达；类分子的表达；2 2、促进、促进Th1Th1细胞分化；细胞分化；3 3、激活、激活NKNK、巨噬细胞；、巨噬细胞；4 4、抑制、抑制Th2Th2细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。病毒病毒病毒复制病毒复制抑制病抑制病 毒复制毒复制信号转导信号转导IFN-a aIFN-诱导蛋白诱导蛋白诱导刺激诱导刺激胞核胞核 胞核胞核 I型

28、干扰素：抗病毒10 12 g干扰素能在培养组织中保护一百万个细胞免受一千万个病毒颗粒的感染4.肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)1975 1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质，该因子对多种肿瘤细胞系具有细胞毒作用，物质，该因子对多种肿瘤细胞系具有细胞毒作用，而且在多种动物模型中可引起肿瘤坏死，将其命而且在多种动物模型中可引起肿瘤坏死，将其命名为肿瘤坏死因子（名为肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis FactorTumor Necrosis Factor，TNFTNF）。）。1984,TNF1984,TNFa a的

29、的cDNAcDNA得以克隆，后来相继克隆得以克隆，后来相继克隆了该家族的多个成员，构成了了该家族的多个成员，构成了TNFTNF超家族细胞因子。超家族细胞因子。TNF超家族特征 绝大多数成员为绝大多数成员为IIII型膜蛋白；在特异性金属蛋白型膜蛋白；在特异性金属蛋白酶作用下，形成可溶形式酶作用下，形成可溶形式 活性形式多为同源三聚体；活性形式多为同源三聚体；TNFTNF超家族超家族包括包括TNFTNFa a,TRAIL,FASL,TRAIL,FASL等；此外，等；此外，尚有一批与尚有一批与TNFTNFa a序列同源，但缺乏诱导凋亡活性序列同源，但缺乏诱导凋亡活性的的TNFTNF家族成员。家族成员

30、。TNF-:TNF-:巨噬细胞产生；巨噬细胞产生；TNF-:TNF-:又称为淋巴毒素又称为淋巴毒素(lymphotoxin-(lymphotoxin-，LT-LT-），主要由活化），主要由活化T T细胞产生；细胞产生；TNF-TNF-和和TNF-TNF-共用受体，功能相似。共用受体，功能相似。骨 髓MjT 细胞B 细胞巨噬细胞中性粒细胞IL-2 IL-4 g-IFNTNF-a上调细胞因子产生水平（IL-2，IL-4，g-IFN，CSF）上调 IL-2 受体的表达诱导分化 上调抗体 产生数量上调前列腺素产生水平 上调细胞因子产生水平（IL-1，IL-6，IL-8，GM-CSF）趋化并活化中性粒细

31、胞体内刺激产生CSF 上调造血功能TNF-a 对 淋 巴 组 织 的 作 用TNF-功能广泛功能广泛:为炎性因子，引起发热、诱导急性期蛋白合成、介导内毒素为炎性因子，引起发热、诱导急性期蛋白合成、介导内毒素性休克性休克可诱导凋亡可诱导凋亡5.趋化因子(Chemokine,CK)是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子。主要功能是招募血液中的单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等进入感染部位,参与免疫调节和免疫病理反应，包括CXC,CC,C,CX3C亚家族 趋化运动是指细胞向高浓度刺激物方向的定向运动。根据蛋白质一级结构进行分类：CXC,CC,C,CX3C亚家族主要功能1 1、趋化作用；、趋化作用；2

32、2、上调整合素的表达，活化白细胞；、上调整合素的表达，活化白细胞；3 3、促进细胞脱颗粒和生物活性物质释放；、促进细胞脱颗粒和生物活性物质释放；4 4、调节血管生成；、调节血管生成；5 5、调控免疫细胞分化、发育、成熟，在周围免疫器、调控免疫细胞分化、发育、成熟，在周围免疫器官正确定位、相互作用，并回到相应组织发挥生官正确定位、相互作用，并回到相应组织发挥生物学作用。物学作用。6.生长因子(Growth factor)具有促进不同类型细胞生长效应的细胞因子，如TGF-、FGF、EGF、VEGF、NGF、PDGF等。VEGF(VEGF-A),VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PlGF(p

33、lacental growth factor).The VEGF family of receptors consists of three protein-tyrosine kinases(VEGFR1,VEGFR2,and VEGFR3)and two non-protein kinase co-receptors(neuropilin-1 and neuropilin-2).These components participate in new blood vessel formation from angioblasts(vasculogenesis)and new blood ves

34、sel formation from pre-existing vasculature(angiogenesis).Interaction between VEGFR1 and VEGFR2 or VEGFR2 and VEGFR3 alters receptor tyrosine phosphorylation.血管内皮生长因子血管内皮生长因子(VEGF)The gene encoding human VEGF consists of eight exons separated by seven introns The first 26 a.a.in VEGF constitute the

35、signaling peptide showing that VEGF is a secreted protein.Alternative splicing of the VEGF gene produces four different isoformsVEGF121,VEGF165,VEGF189,VEGF206 VEGF145 and VEGF183 In VEGF secreting cells,the most frequent isoform is VEGF165,a homodimer with molecular mass 45 kDthere is a mechanism t

36、hat enables selection of just some endothelial cells inside the capillary to initiate angiogenic expansion.These cells called“tip-cells”occupy the leading position while new vessels grow:they react to the VEGFA gradient that specifies the direction of their migration and move forward of the growing

37、capillary.Angiogenic stimulus causes major change in the tip-cell phenotype.They acquire such properties as invasiveness and the ability to migrate.They also activate secreted or cell surface proteases for partial destruction of adjacent basement membrane.7、转化生长因子（TGF-）TGF-TGF-超家族是一组调节细胞生长和分化的蛋白质家族超

38、家族是一组调节细胞生长和分化的蛋白质家族,这个家族至少有这个家族至少有2525个成员，除了个成员，除了TGF-TGF-外还有活化素，抑外还有活化素，抑制素，骨形成蛋白，胶质细胞源性神经营养因子家族等制素，骨形成蛋白，胶质细胞源性神经营养因子家族等 TGF-TGF-的命名是根据这种细胞因子能使正常的成纤维细胞的命名是根据这种细胞因子能使正常的成纤维细胞的表型发生转化的表型发生转化,即从贴壁即从贴壁琼脂中生长。琼脂中生长。分子结构和编码基因 19851985年克隆成功年克隆成功,哺乳动物有哺乳动物有:TGF-1,TGF-2,:TGF-1,TGF-2,TGF-3,TGF-4TGF-3,TGF-4四个

39、亚型四个亚型,前三种为同源二聚体分前三种为同源二聚体分子子Pre-pro-TGF-Pre-pro-TGF-N pro-TGF-Pre-pro-TGF-Pre-pro-TGF-N pro-TGF-TGF-(TGF-(有活性有活性)TGF-的产生1、机体多种细胞都可分泌非活性状态的TGF-。2、活化的淋巴细胞TGF-水平增高。3、几乎所有肿瘤细胞均可检测到TGF-mRNA。生物学活性1 1、抑制细胞增殖：对大多数细胞的增殖具有抑制作用，因此、抑制细胞增殖：对大多数细胞的增殖具有抑制作用，因此TGF-TGF-具有形态发生、免疫抑制和肿瘤抑制的作用。具有形态发生、免疫抑制和肿瘤抑制的作用。2 2、它在

40、肿瘤的转移中又可以发挥促进作用，特别是在、它在肿瘤的转移中又可以发挥促进作用，特别是在EMTEMT中发中发挥了重要作用。挥了重要作用。3 3、对细胞表型的调节：抑制、对细胞表型的调节：抑制IL-2IL-2诱导诱导T T细胞表达细胞表达IL2RIL2R，TfRTfR等，等，抑制抑制IFNIFN诱导黑色素细胞表达诱导黑色素细胞表达MHCIIMHCII抗原抗原4 4、促进、促进Treg,Th17Treg,Th17细胞的增殖分化。细胞的增殖分化。、抑制细胞因子的产生：如、抑制细胞因子的产生：如TNF/TNF/，IFNIFN，IL-4IL-4，IL-12IL-12上皮间质变迁上皮间质变迁（epithel

41、ial-mesenchymal transition,EMT）EMTEMT是细胞转分化的一种方式。是细胞转分化的一种方式。特点：特点：上皮细胞的极性消失上皮细胞的极性消失-细胞与细胞之间的连接丧失；细胞与细胞之间的连接丧失；细胞骨架和细胞器的分布状态发生改变等；细胞骨架和细胞器的分布状态发生改变等；细胞表达间质细胞特有的某些分子如波形蛋白（细胞表达间质细胞特有的某些分子如波形蛋白（vimentin),vimentin),上皮细胞的标志分子如上皮细胞的标志分子如E-cadherinE-cadherin则消失则消失;细胞出现迁移和运动能力。细胞出现迁移和运动能力。EMTEMT的核心过程是细胞极性模

42、式的变迁的核心过程是细胞极性模式的变迁-上皮细胞的稳定极上皮细胞的稳定极性模式消失，代之以间质细胞的动态极性模式。性模式消失，代之以间质细胞的动态极性模式。上皮间质变迁与癌细胞演变上皮间质变迁与癌细胞演变 癌症的传统定义是上皮组织的恶性细胞病变。癌症的传统定义是上皮组织的恶性细胞病变。起源于上皮组织的癌细胞从原发上皮细胞的稳定起源于上皮组织的癌细胞从原发上皮细胞的稳定极性模式演变为少数具有迁移能力的细胞才具有极性模式演变为少数具有迁移能力的细胞才具有的动态极性模式，从而获得了侵袭和转移的能力，的动态极性模式，从而获得了侵袭和转移的能力，此即癌细胞演进的此即癌细胞演进的EMTEMT学说。学说。与

43、EMT相关分子 许多抑癌基因的功能丧失性突变或表达下调与EMT有关,如：APC,CDH1,-catenin，PTEN等,许多生长因子参与了EMT,如EGF,TGF,HGF,FGF等，特别是TGF在EMT中起到了重要作用，在多条通路中都发挥作用 vector AKT/AKTTransientad-V 4DayStableSylvia Julien Grille et al.,“The Protein Kinase Akt Induces Epithelial Mesenchymal Transition and Promotes Enhanced Motility and Invasivenes

44、s of Squamous Cell Carcinoma Lines,”Cancer Res 63,no.9(May 1,2003):2172-2178.一个新的抑制EMT细胞因子的发现Part.E-Cadherin redistribution&down-regulationSylvia Julien Grille et al.,“The Protein Kinase Akt Induces Epithelial Mesenchymal Transition and Promotes Enhanced Motility and Invasiveness of Squamous Cell Ca

45、rcinoma Lines,”Cancer Res 63,no.9(May 1,2003):2172-2178.AKT STABLECltr.BCltr.CCltr.Esh3.Ash3.Csh3.E0H24H36H0H24H36H 细胞因子受体细胞因子发挥广泛多样的生物学功能是通过与靶细胞膜表面的受体相结合并将信号传递到细胞内部。因此，了解细胞因子受体的结构和功能对于深入研究细胞因子的生物学功能是必不可少的。从细胞因子结合其受体开始，到某些基因转录的启动，要经历复杂的细胞内分子间的相互作用，这样的作用过程称为细胞因子的信号转导；细胞因子受体都是跨膜蛋白，由胞膜外区、跨膜区和胞浆区组成。CC C

46、 CC1C3C2C1C3C2C1C3C2C1C3C2G 蛋白蛋白 I类细胞类细胞因子受体因子受体II类细胞类细胞因子受体因子受体TNF-R趋化因趋化因子受体子受体1.I型细胞因子受体家族：（造血因子受体家族）2.型细胞因子受体家族：（干扰素受体家族）3.型细胞因子受体家族：（肿瘤坏死因子受体家族）4.趋化性细胞因子受体（CKR）家族：1.造血细胞因子受体超家族（I类）结构特征：是细胞因子受体中最大的一个家族，多数成员属于多亚单位受结构特征：是细胞因子受体中最大的一个家族，多数成员属于多亚单位受体，其中一种或两种亚单位多肽负责结合细胞因子体，其中一种或两种亚单位多肽负责结合细胞因子膜外区序列结构

47、相似于膜外区序列结构相似于EpoR,EpoR,即膜外即膜外N N端含端含4 4个高度保守个高度保守Cys,Cys,近膜侧含近膜侧含1 1个个Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser(WSXWS)Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser(WSXWS)的基序的基序D2002.IFN受体家族(II类细胞因子受体家族)结构特征：两条肽链组成，胞外区结构特征：两条肽链组成，胞外区Fn3Fn3样结构域由样结构域由200200个氨基酸残个氨基酸残基组成，也称基组成，也称D200D200，并含有，并含有4 4个不连续的半胱氨酸，包括个不连续的半胱氨酸，包括IFNIFN和和IL-10IL-10受体受体7个aa22个

48、aaIL-10TNF a aTNF CD40LNerve growth factor(NGF)FASL3.TNFR超家族 主要包括：主要包括：TNFTNF、FasFas、CD40CD40、神经生长因子受、神经生长因子受体体等等 结构特征：结构特征：这类受体富含半胱氨酸，在与细胞因子结合这类受体富含半胱氨酸，在与细胞因子结合后三聚体化。胞外区有后三聚体化。胞外区有3-53-5个由个由4040个氨基酸残基个氨基酸残基组成的重复亚单位；每个重复亚单位含有组成的重复亚单位；每个重复亚单位含有4-64-6个个保守的半胱氨酸；形成保守的半胱氨酸；形成“配体结合区域。配体结合区域。TNFR ITNFR I（

49、P55P55，CD120aCD120a）：胞内同源序列即）：胞内同源序列即“死死亡结构域亡结构域”TNFR IITNFR II（P75P75，CD120bCD120b）不含死亡结构域）不含死亡结构域L肿瘤坏死因子受体可发挥免疫调节作用 肿瘤坏死因子受体家族的肿瘤坏死因子受体家族的CD40CD40和和FASFAS具有重要的免疫具有重要的免疫调节作用调节作用:CD40-BCD40-B细胞，巨噬细胞细胞，巨噬细胞CD40LCD40L，FASL-FASL-效应效应T T细胞细胞CD40L+BCD40L+B细胞细胞CD40CD40B B细胞增生，细胞增生，IgIg类别转换类别转换CD40L+CD40L+

50、巨噬细胞巨噬细胞CD40-CD40-巨噬细胞分泌巨噬细胞分泌TNFTNFFAS+FASL-FAS+FASL-表达表达FASLFASL的的CTLCTL可清除表达可清除表达FASFAS的淋巴细胞，的淋巴细胞，这是一种重要的免疫应答的负反馈调节机制。这是一种重要的免疫应答的负反馈调节机制。4.趋化因子受体超家族 结构特征：是G蛋白偶联受体G-binding protein coupled receptor,G-PCR)。由7个疏水性的跨膜区组成，又称7个穿膜区受体超家族。和相应的配体结合后，经偶联GTP结合蛋白而发挥生物学效应 CKR分类分类1 1、根据结合配体的不同，分为、根据结合配体的不同，分为

51、CXCRCXCR，CCRCCR，XCR,XCR,CX3CRCX3CR；2 2、根据特异性不同，分为特异性受体、共享性受体、根据特异性不同，分为特异性受体、共享性受体、杂合性受体（杂合性受体（DARCDARC：DuffyDuffy血型抗原，红细胞趋化血型抗原，红细胞趋化因子受体）、孤儿受体、病毒受体等。因子受体）、孤儿受体、病毒受体等。CXCR4CXCR4和和CCR5CCR5是是HIVHIV感染的共受体感染的共受体(Co receptors)(Co receptors)HIV-1 HIV-1病毒嗜细胞特性病毒嗜细胞特性 与HIV 有关的趋化因子受体还有 CCR2,CX(3)CR1等。（二）细胞因

52、子受体的几个特点1.细胞因子受体共同链 两个或更多细胞因子受体亚单位组成异聚或多聚体形式，包括两个或更多细胞因子受体亚单位组成异聚或多聚体形式，包括一特异性配体结合（一特异性配体结合（a a链，低亲和力受体）和一个参与信号转链，低亲和力受体）和一个参与信号转导链（导链（链，参与高亲和力受体形成和信号转导）。链，参与高亲和力受体形成和信号转导）。g gC高亲和力IL-2 受体g g g g a aa a低亲和力IL-2受体中等亲和力IL-2 受体IL-2IL-2IL-2 受 体IL-2R IL-4R IL-7R IL-9R IL-15R IL-21Rg g-链参与组成的细胞因子受体链参与组成的细

53、胞因子受体共用的共用的 g g 链链gC突变导致T细胞发育障碍Cytokine receptors that share g gC subunit and their functions.gp130参与造血因子受体家族高亲和力受体形成参与造血因子受体家族高亲和力受体形成和信号转导，不直接参与配体结合和信号转导，不直接参与配体结合细胞因子受体共用链的意义细胞因子受体共用链的意义 节约；节约；细胞因子功能替代；细胞因子功能替代；共用链缺失或功能缺陷，将引起严重后果，如共用链缺失或功能缺陷，将引起严重后果，如IL-IL-2R2R亚家族的亚家族的 g 链缺陷，将引起链缺陷，将引起SCIDSCID。2.

54、可溶性细胞因子受体(sCKR)产生方式：产生方式：大部分为膜受体脱落，如大部分为膜受体脱落，如SIL-1RSIL-1R、SIL-2RSIL-2R、sTNFRsTNFR、sIFNrRsIFNrR、sGM-CSFRsGM-CSFR、sIL-5RsIL-5R、sIL-6RsIL-6R等等小部分为分泌型，如小部分为分泌型，如sIL-4RsIL-4R、sG-CSFRsG-CSFR、sIL-5RsIL-5R、sIL-6RsIL-6R 生物学活性：生物学活性：膜受体正常代谢途径膜受体正常代谢途径 膜受体相应配体膜受体相应配体“竞争抑制剂竞争抑制剂”应用：应用：检测，治疗检测，治疗sCKRsCKR与临床：与临

55、床：检测：sIL-2R：恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染与其他传染性疾病、移植排斥反应等sIL-6R：炎症与自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤和白血病等sTNFR：炎症与自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤和白血病、骨髓移植等 治疗治疗：大多数sCKR与细胞因子结合后阻断细胞因子与膜受体结合，从而抑制细胞因子的生物学活性。应用sCKR为减轻或防止细胞因子造成的病理损害提供了新的治疗途经。3.细胞因子受体有天然拮抗剂 IL-1受体拮抗剂 病毒产生的细胞因子结合蛋白，TNF，IL1细胞因子受体的信号转导 细胞因子受体的信号转导主要利用2个信号转导途径：JAK(Janus kinase)-STATRas

56、MAPK激酶途径 细胞因子介导的信号转导细胞因子介导的信号转导Cytokine induced signal transduction细胞因子结构与功能特点 结构：同源性低，小分子蛋白，多为单链，少为双链、三聚体（TNF）、多含糖基 量微而活性强（pmol/L）细胞因子作用是作为细胞之间的信使细胞因子作用是作为细胞之间的信使 细胞因子作用特点：细胞因子作用特点：旁分泌或自分泌，瞬时、距离范围小旁分泌或自分泌，瞬时、距离范围小 通过与相应受体结合发挥作用通过与相应受体结合发挥作用 细胞因子诱导的受体亚单位聚合可以活化蛋白酪氨细胞因子诱导的受体亚单位聚合可以活化蛋白酪氨酸激酶酸激酶(JAK),(J

57、AK),导致转录因子导致转录因子STATSTAT酪氨酸磷酸化而激酪氨酸磷酸化而激活靶基因转录活靶基因转录 多效性、重叠性、拮抗性、协同性、网络性：多效性、重叠性、拮抗性、协同性、网络性：生理调节、病理反应生理调节、病理反应89细胞因子间可相互诱生：IL-1能诱生IFN、IL-1、IL-2、IL-4等，IL-2能诱生TNF、IL-2、LT等。细胞因子可调节细胞因子受体的表达：IL-1、IL-5、IL-6等可促进IL-2受体的表达；IL-1能降低TNF受体的密度，细胞因子与生物活性 之间的相互影响。B细胞和T细胞活化过程中，常需要两种以上细胞 因子的协同作用或彼此调节。自分泌自分泌内分泌内分泌远距

58、离作用远距离作用旁分泌旁分泌作用于比作用于比邻细胞邻细胞作用于分泌作用于分泌细胞自身细胞自身细胞因子分泌的方式细胞因子分泌的方式血液循环血液循环 多效性多效性重叠性重叠性（丰裕性）（丰裕性）拮抗性拮抗性协同性协同性TH1MjIL-4 骨髓基质细胞IL-1 IL-6 IL-7 SCF 造血干细胞IL-1 IL-6 IL-11 TNF-a GM-CSF G-CMF M-CSF单核细胞TH2B中性粒细胞嗜酸性粒细胞IL-1 IL-8 TNF-aIL-1 TNF-aIL-10 IL-4IL-4 IL-6 IL-10 IL-13 IL-4 TGF-IL-4 IL-5 IL-6 IL-13 IL-10 T

59、GF-IL-4IL-4内皮细胞IL-4TcIL-4IL-2 IFN-gIL-10 IL-13 IL-4 NK1+T NK 细胞IFN-gIL-2IL-2 IFN-gIL-2IL-2 IL-12G-CMF IFN-g GM-CSF IL-12IL-1 TNF-a TGF-PDGF FGF M-CSF GM-CSF 内皮细胞纤维母细胞下 丘 脑IL-1 TNF-aM-CSF GM-CSF IL-1 IL-6 TNF-aIL-4IL-6IL-4细胞因子的作用具有网络性细胞因子的作用具有网络性 主要生物学效应 抗感染（细菌和病毒）肿瘤()刺激造血细胞增埴分化 免疫细胞的分化 免疫调节作用 细胞因子佐剂

60、 其它：促进血管生成，参与炎症反应、各种细胞的生长和分化参与免疫应答与免疫调节参与免疫应答与免疫调节 免疫应答识别（感应）阶段免疫应答识别（感应）阶段 IFN-IFN-g g刺激刺激APC MHC-IIAPC MHC-II的表达的表达 IL-10IL-10抑制抗原递呈抑制抗原递呈 免疫应答细胞扩增阶段免疫应答细胞扩增阶段 IL-2IL-2、IL-4IL-4、IL-5IL-5、IL-6IL-6等促进等促进T T、B B细胞的增殖与分化细胞的增殖与分化 TGF-TGF-抑制淋巴细胞增殖抑制淋巴细胞增殖 免疫应答效应阶段免疫应答效应阶段 趋化因子吸引炎症细胞趋化因子吸引炎症细胞 TNF-TNF-a

61、a、IL-1IL-1、IFN-IFN-g g、GM-CSFGM-CSF等激活巨噬细胞，增强吞噬杀等激活巨噬细胞，增强吞噬杀伤活性伤活性 TNF-TNF-a a、TNF-TNF-具有细胞毒性并刺激中性粒细胞具有细胞毒性并刺激中性粒细胞 IFN-IFN-g g抑制病毒复制抑制病毒复制 在免疫应答过程中，免疫细胞之间通过细胞因子相互刺激、在免疫应答过程中，免疫细胞之间通过细胞因子相互刺激、彼此约束，对免疫应答进行调节，维持免疫系统的稳态平衡彼此约束，对免疫应答进行调节，维持免疫系统的稳态平衡细胞因子与疾病 细胞因子及受体缺陷 细胞因子过高表达 可溶性受体水平升高细胞因子的检测 用于判断机体免疫功能，

62、进行疾病辅助诊断，判断病程，预后，评价治疗效果 细胞因子检测常用方法细胞因子检测常用方法 生物活性检测法生物活性检测法(biossay)-(biossay)-检测细胞因检测细胞因子的生物学活性子的生物学活性 免疫学检测法免疫学检测法(immnuossay)-(immnuossay)-检测细胞检测细胞因子蛋白质的抗原特性因子蛋白质的抗原特性 分子生物学检测法分子生物学检测法-检测细胞因子的检测细胞因子的mRNAmRNA表达表达生物活性检测法 增殖实验增殖实验：应用某一细胞因子能特异刺激或抑制某些指示细胞的增殖应用某一细胞因子能特异刺激或抑制某些指示细胞的增殖,通过通过 3 3HTdRHTdR摄入

63、摄入,MTT,MTT,反应待测细胞因子的活性水平反应待测细胞因子的活性水平;集落形成实验集落形成实验：半固体培养系统半固体培养系统,造血因子集落刺激因子诱导干细胞造血因子集落刺激因子诱导干细胞形成某一或某些种类的集落形成某一或某些种类的集落.直接杀伤靶细胞直接杀伤靶细胞：3 3HTdRHTdR、5151CrCr释放法释放法 抗病毒活性抗病毒活性：干扰素抑制病毒致病变的程度干扰素抑制病毒致病变的程度,计算样品中计算样品中IFNIFN的活性单的活性单位位 凋亡实验：凋亡实验：各种试剂盒、流式细胞仪各种试剂盒、流式细胞仪 趋化实验趋化实验：琼脂糖中的趋化实验、微孔小室趋化实验琼脂糖中的趋化实验、微孔

64、小室趋化实验 迁移、侵袭实验迁移、侵袭实验：划痕试验、：划痕试验、transwelltranswell细胞增殖常用方法细胞增殖常用方法 3H-thymidine incoroperation 法 将PBMC 2106/ml 置於 96-well plate,再加入 RPMI 培养基或添加有 LPS(lipopolysaccharide),Con A,PHA,PWM 等细胞丝裂原的培基。於 37 CO2 培养箱2天後，加入 1 Ci/well 3H-胸腺嘧啶（thymidine），继续培养 8小时后，以 cell harvester 收集细胞于滤纸上，风干后以闪烁计数仪测 3H-thymidin

65、e 含量，计算细胞增殖能力。MTT法基本可以替代。Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan(参考图1)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。TranswellTranswell 将TranswellTranswell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下

66、层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。肿瘤细胞迁移实验肿瘤细胞迁移实验 8.0、12.0m膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。肿瘤细胞侵袭实验肿瘤细胞侵袭实验 8.0、12.0m膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。transwell侵袭实验，原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞要把基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了。免疫学检测法免疫学检测法(1)(1)可溶性细胞因子检测可溶性细胞因子检测:放射免疫测定（放射免疫测定（RIARIA）特异特异AbAb包被包被+待测样品和同位素标记的待测样品和同位素标记的细胞因子细胞