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1、感受态细胞的制备（DH5a）一、准备工作所有试剂、容器均需提前预冷。1、实验器械4C离心机（50ml离心管），37C恒温箱，37C摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22p m的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液）,10ml注射器2个；冰盒；高压 灭菌的1.5mlEP管1 盒,与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200p l枪头各一 盒。2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧） LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。 SOB 培养基（
2、Super Op timal Bro th） TfB I： （100ml 制备量）分别称取乙酸钾 0.294g, MnC 0.99g, KCl 0.146g, CaCl? 0.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW,摇晃，使其全部溶解。然后在安 全橱中用孔径为0.22p m的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4C保存， 使用前必须预冷。（装在50ml离心管，封口 4度保存） TfBlI（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g, CaCl? 0.167g, KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘
3、油和17mlDDW,摇晃，使其全部溶解。 然后在安全橱中用孔径为0.22p m的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。终体积TFB1浓度100ml200 ml250 ml1LKAc30 mM0.249g0.588 g0.623 g2.49 gKCl100 mM0.146g0.292 g0.365 g1.46 gCaCl210 mM0.111g0.223 g0.278 g1.11 gMnCl 4H O2 2150 mM0.99g1.98 g2.475g9.9 gGlycerol15%15ml30 ml37.5 ml150 ml先用部分去离子水溶解，后定容至要求体积。用0.2 M醋酸调pH值至5.8 （
4、非 常关键），用针式过滤器过滤除菌，4度保存。TFB2浓度20ml200 mlMOPS10 mM0.042g0.42gCaCl275 mM0.164g1.64 gKCl10 mM0.015g0.15gGlycerol15%3 ml30 ml先用部分去离子水溶解，后定容至要求体积。用1 M KOH调pH值至6.5，用针式过滤器过滤除菌，放在冰上当天现配现用SOB 培养基 配制量 1 L配制方法 1.配制250 mM KC1溶液。（50ml离心管分装）在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。2.配制2 M MgCl2溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml去离子水
5、中溶解4.06g MgCl26H2O后，定容至100 ml, 高温高压灭菌。3称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone20 gYeast Extract5 gNaCl0.5 g4. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。5. 量取10 ml 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。6. 滴加NaOH小块，调节pH值至7.0。7. 加入去离子水将培养基定容至 l L。8. 高温高压灭菌后，4C保存。9. 使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。LB 培养基配制量 1 L配制方法1称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone10 gYeast Extract5 gNaCl
6、10 g2. 加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。3. 滴加固体NaOH，调节pH值至7.0。4. 加去离子水将培养基定容至 1 L。5 高温高压灭菌后， 4度保存。二、实验步骤1、第一天：下午3点取出-80的感受态细胞DH5a，冰浴，用枪头沾一点（就可以带出很 多细菌，剩余的不要了），在500ul的LB液体培养基中吹打（轻柔），取50ul至另一个500ul 的LB中再稀释，取100ul涂板。37度恒温箱培养过夜约16h （具体时间观察单克隆，可以 顺利挑菌就行）。2、第二天早上，观察是否长出单个菌落，菌落大小合适时，向2个无菌的摇菌管分别加入 5ml高压过的SOB培养液，标注为对
7、照管和DH5a管。从LB平板上挑取单个菌落加入 DH5a 管中，220rpm, 37C, 5h, 0D550 达 0.3,将 5mlS0B 倒入 lOOmlSOB, 37 度，220rpm， 3.5h 后，OD55O 达 0.36 （T43.7%）,取出冰上放置 5min；3、将100ml菌液转入两个离心瓶中（平底），spin 3K,5,4C，倒净上清，倒置于 吸水纸上吸干剩余上清。之后步骤必须冰上进行，盐处理细胞后，操作轻柔;4、每管加入20ml Tbfl重悬，轻柔操作，冰上放置5, spin 3K,5,4C。倒去上清， 并倒置于吸水纸上;5、每管加入2ml Tbf ll重悬，轻柔操作，冰上放置15;6、每管 50ul 分装。液氮速冻， -80 度储存，标明制作日期，细菌种类;7、留出一管做鉴定，分别直接涂布阴性，含AMP，含Kana的板子；再分别转化抗AMP和抗 Kana的质粒，分别涂布含AMP,含Kana的板子，第二天验证感受态状态。8、正常感受态在阴性板子中长，在含AMP,含Kana的板子中不长；转化抗AMP和抗Kana 的质粒后分别后分别在含AMP,含Kana的板子中生长。（每个都需涂2个板，含AMP,含 Kana 的板子）
感受态细胞的制备
