常用分子生物学技术的原理及应用76

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1、常用分子生物学技术的原理及应用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Techniquen核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理复

2、性RNADNA（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。（二）探针技术二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹(Southern blotting)（二）RNA印迹(Northern blotting)（三）蛋白质的印迹(Western blotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。用于RNA

3、的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。n其他：斑点印迹(dot blotting)原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵(DNA array)DNA芯片技术(DNA chip)三种印迹技术的比较分子杂交实验放射自显影照片DNA芯片技术PCR技术的原理与应用The Principle and Application of PCR Technology5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA一、PCR技术的工作原理55 555 5 55Cycle 355 555 5 555 5 55 555 5

4、2530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。PCR技术原理示意图 n PCR的基本反应步骤变性95C延伸72C退火Tm-5C 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR体系基本组成成分利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造

5、。PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突变将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。（四）DNA序列测定（五）基因突变分析 逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将是将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反应联合反应联合应用的一种技术。应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因是目前从组织或

6、细胞中获得目的基因以及对已知序列的以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分进行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。（一）逆转录PCR技术三、几种重要的PCR衍生技术 原位原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或或RNA是否在该组织或细胞中存在。是否在该组织或细胞中存在。原位原位PCR方法弥补了方法弥补了PCR技术和原位杂交技术技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的的不足，是将目

7、的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。一种最佳方法。（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。n实时PCR技术原理QR3355上游引物下游引物荧光标记引物RQ 3355n实时PCR分类：实时PRC非探针类探针类1.TaqMan探针法 2.分子信标探针法 3.FRET探针法 图20-3 TaqMan探针法实时PCR原理示意图基因文库Gene Library 基因组DNA文库(genomic DNA library)cDNA文库(cDNA library)n基因文库(ge

8、ne library)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。一、基因组DNA文库基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。n基因组文库和cDNA文库的构建和筛选第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选n基因组文库筛选结果举例cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、cDNA文库生物芯片技术Biological Chip Technique是指将许多特定的D

9、NA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。一、基因芯片n基因芯片(gene chip)n基因芯片工作流程示意图是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应n蛋白质芯片(protein chip)n蛋白质芯片作用原理生物大分子相互

10、作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。标签融合蛋白沉淀实验流程示意图（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途n酵

11、母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。（三）免疫共沉淀技术的基本原理和用途 免疫沉淀（免疫沉淀（immunoprecipitation IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。利免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合用抗体可与抗原特异性结合的特性，将

12、抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。体系沉淀下来。免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。相互作用的有效方法。CO-IP与质谱分析与质谱分析 以细胞内源性靶蛋白为诱饵以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀纯化靶蛋白免疫复合物疫共沉淀纯化靶蛋白免

13、疫复合物，凝胶电泳分离后凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白白的结合蛋白n免疫沉淀原理图解n免疫共沉淀原理图解n免疫共沉淀原理图解蛋白A，蛋白B 抗A抗体C进行洗脱抗B抗体D进行验证IP C ACO-IP C A+B DnCO-IP与质谱分析流程电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二

14、、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图染色质免疫沉淀技术(c h r o m a t i n immunoprecipitation assay,ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图二、RNA-蛋白质相互作用分子分析技术RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况

15、的技术。应用范围：研究蛋白与DNA动态作用研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达之间的关系研究蛋白与RNA的相互作用激光共聚集显微镜应用技术Laser Scanning Confocal Microscopy(LSCM)激光经放大、分光后由物镜聚焦于焦平面上，同时，焦平面上被激光扫描的点F所发出的一定波长的荧光通过检测针孔光栏达到检测器，并成像于显示器上，得到相应的荧光图象。n激光共聚焦显微镜工作原理示意图n人眼及各类显微镜分辩率 人眼分辩率 0.20mm 光学显微镜分辩率 0.25um 共焦显微镜分辩率 0.18um 电子显微镜分辩率 0.20nm 激光共聚焦显微镜有四个荧光通道，一个透射光通道n激光共聚焦显微镜的应用定位、定量三维重组动态测量 活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化 测量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)自由基的检测 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位活细胞内H+浓度（pH值）的测量线粒体膜电位的测量荧光漂白恢复（FRAP）的测量笼锁解笼锁的测量荧光能量共振转移（FRET）的测量其他应用