液相色谱串联质谱联用技术

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1、（2014、2015 级）课程内容（一个实验8学时）：（1）AB Sciex Qtrap 4500三重四级杆/离子阱 液相色谱串联质谱联用仪的结构 原理、操作与定性定量应用。（2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量。吉林农业大学 农业部参茸质检中心2017.03实验一 AB Sciex Qtrap 4500三重四级杆/离子阱 液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作与定性定量应用一 实验目的和意义通过学习液质联用仪的构成和使用方法，与其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质 联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告 和良好的

2、实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意 识）。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实 际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以与归纳总结的能力等。（一）检测仪器1、 仪器名称 高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS）。型号：4500 QTRAP （美国 Applied Biosystems 公司）。2、仪器组成液相色谱部分：岛津LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器； 串联质谱部分：QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱。3、 主要性能指标 离子化方式：

3、ESI电离 质量范围：（51700）amu分辨率： 6900质量 稳定性：0.1 amu/12h 灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM 扫描（m/z : 609/195），信噪比 S/N 120:1 扫描速度：4000 amu/sec质量准确度： 0.01% （全质量数范围）4、方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流 动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次 进入离子源。在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离,被加速后进入质量分析器。4500QTRAP 的质量分析器主要由Q1、Q2、Q

4、3三组四级杆串联组成。Q1可将分子离子按质荷比（m/z）大小分 开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作 为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵 敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录 即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技 术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物 进行定量分析。整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows

5、操作系统支持下的Analyst软件控制完成。（二）样品1、样品要求 本仪器适合分子量在51700 amu范围内的有机样品的定性与定量分析。待测 样品必须能溶解于水或其它有机溶剂中。若样品或配制的样品溶液发生沉淀、挥发、变质等异常现 象时，应重新取样或重新配制溶液。2、试剂要求 所有的试剂均选用色谱纯级，所用水的电导率应大于18KQ。流动相必须用0.2pm 或0.45pm滤膜过滤后方可使用。3、分离条件要求在液相色谱仪上确定分离条件，使待测组分能完全分离，且该色谱条件中流 动相不应含有不挥发性盐，如磷酸盐。（三）、操作步骤 实施检测操作的人员，必须熟悉该仪器的操作规程，仪器的工作状态、包括检测

6、灵敏度和分辨率，必须满足检测项目的要求。1、开机前准备开机前应检查仪器室内电、气的供应情况与空调机的工作状态是否稳定，检 查真空机械泵泵油是否需要更换。只有当UPS工作正常，Gas1/Gas2、Curtain Gas和Exhaust Gas的 压力分别稳定在0.35、0.35和0.7 Mpa,环境温度为1030C，相对湿度小于70%时才能开机。2、 开机1）打开真空机械泵上的电源开关。2）真空机械泵继续工作至少15分钟后，打开 MS电源主开关。3）等真空度达到2X10-5Torr （绿色指示灯不闪）后，打开PC计算机电源3、仪器调谐（四）、方法建立1. 在 Analyst 软件 Tools 菜

7、单中选择 ProjectCreate Project。在 Project name 项下输入新建的 Project 名称。注意，不要点选窗口中的其他按钮！点击OK,确认新建Project。2. 在 Analyst软件界面下，双击导航栏内Hardware Configuration。在弹出窗口中选择MassOnly， 点击Activate Profile，激活MassOnly （只联接质谱主机）。3. 在导航栏内单击Tune and Calibrate，进入调谐模式。点击上方工具条中的T钮。此时，应注 意到主机有“扑”声音，表明进入调谐状态。此时右下角质谱状态显示绿色。双击Manual Tuni

8、ng，进 入质谱参数设置与运行窗口。4. 使用1mL玻璃进样针吸取适当标准溶液，置于进样针座上。点击MS Method下拉菜单，选择 Syringe Pump Method，设定针泵流速 Flow Rate 为 10yL/min。5. 点击Start Syringe Pump按钮开针泵进样。6. 返回MS Method，选择扫描模式Scan Type为Q1 MS，设定扫描速度Scan Rate为10Da/s，设定扫描范围StartStop设定为50化合物分子量。DP预输入60。7点击start开始采集数据。运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值 在约E4以下。点击stop，

9、选择第一个峰（后面是同位素峰）的平稳段，双击，选中母离子。点击右 键，选择 Delete Pane。8.设定Scan type为产物离子扫描Product Ion （Ms2）,扫描速度200Da/s，选择扫描正/负离子， 输入母离子（product of）,设定扫描范围startstop为50MW+20,覆盖可能的子离子质量范围，点击 compoud 标签，设定（DP） 60，（CE） 5。9点击start，开始采集数据，注意观察是否有预期的母离子出现。手动调节CE，以5eV为步长， 逐渐增加。每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰看见。选择平稳的一段，双击，选 择子离子。10. 选择

10、Scan Type为MRM。设定参数表格中的Q1对应的母离子，Q3对应的子离子，time （ms） 为50，ID值设为名称1 （定量），名称2 （定性）。11. 点击Edit Ramp，在Parameter下选择Collision Energy，点击OK。点击start开始采集数据， 记录每个MRM通道的最佳CE电压。在MRM参数设定表中，右键点击。选择Collision Energy CE， 调出表格中的CE列，输入每个MRM通道的最佳CE电压值，精确到个位数。重复以上步骤，在 Parameter项下选择Declustering Potential，优化并保存DP。完成后选择菜单保存采样方法

11、，文件 名.dam。（五）LCMS方法的建立：1、连接仪器：打开HPLC质谱电源，将HPLC系统接上柱子，将6号出口管线与离子源连好。 调离子源喷雾针位置到2mm处，双击Hardware Configure，在硬件配置菜单下单击LCMS （液相与 质谱联用），单击Activate profile激活仪器，会听到笛的一声，说明仪器已经连接上。2、确认液质同步：选择项目（之前优化方法的时候已经建立的项目）；双击Build acquisition method新建方法，弹出新建方法模板。在模板左侧点击acquisition method，模板右边显示对应的参 数，确认synchronization

12、mode选择LC Sync,表示液质同步。3、设置MRM参数:点击方法模板左侧的MRM,在模板右侧Scan Type下选择MRM；在polarity 下选择化合物极性：Positive（正离子）、Negative （负离子）；Duration为15min（与液相分离相同的时 间）；表格中Q1：母离子分子量，Q3（Da）:子离子分子量，Time （msec）： 50，ID栏：化合物名称（离子对名称后空格加1为定量，空格加2为定性），在表格中右键分别单击DP、CE,点击工具栏 的OPEN打开之前优化的方法参数，调出DP,CE值，选中整行，Ctrl+c（复制）参数，关闭窗口，再 Ctrl+v（粘贴）

13、参数）；最后点击Edit parameter设置离子源参数：Source/Gas项用以下推荐值：CUR 35， IS:5500（正离子）或-4500 （负离子）,TEM 600，GS1 60，GS270，点击 OK。4、设置液相参数：点击模板左边的shimadzu LC system,在右边的pumps栏下，设置stop time（运行时间）为15min, flow流速为ImL/min, A为水相设为95%, B为有机相设为5% （设置时改B，A自动），泵最大压力为50；点击time program设置液相梯度：例咪唑类梯度设置：Time(min)AB-95%5%55%95%105%95%10

14、.195%5%1595%5%接着在右边的Auto sampler栏下，设置清洗时间，在Rinse mode下选择Before and after（前后 都洗），并设置清洗时间为5s,清洗液用50%甲醇水。最后点击保存按钮，在保存窗口输入该方法的 名称。（五）数据处理双击打开Multiquilt,选择项目，点击File下的荧光棒型图标，点击sample,选择需要的标准品 和样品数据，点击next, create new method，为方法命名，点击next，选择一个有代表性的样品（一 般选择浓度较大的标品数据），设置分组（同一物质定量离子和定性离子设置为一组）并指定内标, next，对每个物质

15、进行积分。设置积分参数：CausianSmoth （平滑）：一般是0,如有毛刺可改成1或2；Expeceted Time （保留时间）：一般不动Expected time范围：一般30s，表示在保留时间15s范围最小峰宽最小峰高背景噪音扣除：可调整目标峰基线以下被积分的面积，比例越高积分越往下，必要时调整。 分峰因子：峰有分叉时设置，如有两个分叉，设置为2,峰分叉不能大于2 单位：设置单位，勾选Apply units to all可将此单位用于所有化合物点击next,点击finish。在新跳出窗口内将标准品选定，输入浓度。查看各化合物积分是否正常, 点击第三个图标查看标准曲线。实验二 利用液相

16、色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量1实验目的：1.1让学生了解利用液相色谱质谱联用仪测定食品、农产品中农药残留等有害化合物的分析流程。1.2利用前2节课所学内容实际处理样品，增强学生实践能力。1.3进一步加强液相色谱质谱联用仪的操作和数据处理。2试剂或材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水为GB/T 6682规定的二级水。2.1乙腈（C2H3N）:色谱纯。2.2 氯化钠（NaCl）： 140 C干燥 4 h。2.3氨基固相萃取小柱：500 mg/6 mL（或性能相当的其它固相萃取柱）。2.4二氯甲烷-甲醇混合液：二氯甲烷+甲醇（体积比）=95 + 5。2.5标准品：见表1。2.6

17、农药标准溶液配制2.6.1标准储备溶液分别准确称取一定量（精确至0.1 mg）农药标准品，用甲醇溶解，逐一配成1000 mg/L的单 一农药标准储备液，密封贮存在-18 C冰箱中，使用期为6个月。表19种农药标准品农药名称纯度（）多菌灵98吡虫啉98啶虫脒98辛硫磷98阿维菌素98克百威98嘧霉胺982.6.2混合农药标准溶液分别准确吸取一定体积的9种农药标准储备溶液（4.8.1）注入同一容量瓶中，用甲醇稀释至刻 度配制成100 mg/L的混合标准储备液，-18C冰箱中密封闭光保存，使用期为3个月。2.6.3混合标准工作液吸取一定体积的混合农药标准储备液，用甲醇配制成O.Olmg/L、0.05

18、 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、 1.0 mg/L、5.0 mg/L的7种农药混合标准工作液，贮于4C以下冰箱中，需现用现配。3仪器设备3.1电子天平：感量0.01 g；3.2 破壁食物料理机：不低于20000 r/min；3.3 均质机：不低于20000 r/min；3.4恒温水浴锅；3.5旋转蒸发仪；3.6氮吹仪。4试验步骤4.1样品制备4.1.1鲜人参取不少于500 g水果于破壁食物料理机中，以不低于20000 r/min的转速将样品制成糊浆状， 充分混匀后装入样品密封盒中直接测定或-18 C保存，备用。4.2样品预处理4.2.1提取称取25 g水果样品（水果品种当季待定

19、），精确至0.01 g，于100 mL具塞离心管中，加入50 mL乙腈，于匀质机中高速匀质1 min,过滤至装有7 g氯化钠的比色管中，振荡200下，静止分 层，吸取10 mL上层有机相于50 mL浓缩管中，60 C水浴中氮气吹至近干，用2 mL二氯甲 烷一甲醇混合液溶解残渣，待净化。4.2.2 净化氨基柱用5mL二氯甲烷一甲醇混合液溶解进行预处理，当溶剂液面达上层筛板表面时，再倒 入上述浓缩管中待净化溶液，用浓缩瓶接收，待液面下降至上层筛板表面，用8 mL二氯甲烷一甲 醇混合液溶解分2次冲洗浓缩管并洗脱小柱，将浓缩瓶中洗脱液于40 C水浴中旋转浓缩至尽干， 氮气吹干后用2.5 mL甲醇和2.

20、5 mL水定容，过0.22 gm滤膜待测。4.3仪器参考条件4.3.1液相色谱串联质谱联用仪：Qtrap 4500三重四级杆/离子阱质谱仪（配岛津30A超高效液相色 谱仪），电喷雾离子源，美国AB SCIEX公司。4.3.2 色谱柱：Kinetex XB-C18, 2.1 mm x 150 mm x 2.6pm4.3.3流动相与流速见表14.3.4色谱柱箱温度：40 C4.3.5进样体积:5.0 pL表1流动相梯度与流速步骤总时间/min流速/ (pl/min)0.1%甲酸铵水溶液/（%）甲醇/ (%)10.0400901026400208036.14005954840059559400901

21、061140090104.4质谱条件:4.4.1扫描方式：正离子扫描，多反应监测MRM；4.4.2 离子源温度（TEM）： 550 C4.4.3电离方式：电喷雾ESI；4.4.4 电喷雾电压：5500 V；4.4.5雾化气压力：60 PSI；4.4.6 气帘气压力：30 PSI ；4.4.7辅助加热气压力：70 PSI；4.4.8标准曲线的绘制分别吸取1.0卩L 0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L混合标准工作液按照仪 器参考条件，由低浓度到高浓度依次进行测定。分别以9种农药的质量浓度（mg/L）为横坐标，以 9种农药的峰面积为纵坐标绘制

22、标准曲线。4.5定性分析根据样液中被测物含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和待测农药的响应 值均在仪器检测的线性范围内。标准工作溶液与样液等体积参差进样测定。4.6 定量计算试料中7种农药的残留量以质量分数3计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，结果保留3位有 效数字，按公式（1）计算：V x V/3 二一13 X p（V X m 2式中：p标准曲线校正后所测定该种农药的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；匕一提取液中有机溶剂总体积，单位为毫升（mL）；V2吸取出用于检测的提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；V3一样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）； m一称取试料的质量，单位为克（g）。