猪脾中DNA的提取及含量测定

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1、 指导教师：滕利荣 Email: 二十世纪是二十一世纪是物理、化学和电子科学生命科学的世纪的世纪生命是生命 =核酸 +蛋白质二十一世纪是核酸、蛋白质的世纪？1、用于研制核酸类药物及保健品2、用于基因诱变3、用于DNA克隆4、用于DNA测序5、用于PCR扩增1、动物组织及器官 脾、肝、胸腺、鱼类精子等。2、植物 种子的胚芽等3、微生物 细菌、酵母菌等核酸的存在形式：核酸的存在形式：J核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在；J真核生物的染色体DNA为双链线性分子；J原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；J有些噬菌体DNA有时为单链环状分子；J病毒

2、的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。核酸的分布：核酸的分布：J95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。JRNA分子则主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核内，15%在细胞器中。1 1、核酸的理化性质、核酸的理化性质J DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。J 核酸和核苷酸 大都呈酸味（除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外）。J DNA、RNA和核苷酸都微溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。J DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。J 在酸性溶液中，DNA

3、、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。J DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。J 核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。J核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP 表示；J DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。JDNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。J RNPmol/L氯化钠中溶解度较大。因此，

4、在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。核酸提取的原理核酸提取的原理J从不同材料中提取DNA的方法不同，分离提取的难易程度也不同。J从高等动植物及细菌中提取DNA难度大一些。由于其DNA 分子量较大。因此易被机械张力剪断。J细菌DNA，除核DNA 外，还有质粒DNA 等。J对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。核酸提取的主要步骤：1）破碎细胞；2）去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子；3）去除其它不需要的核酸分子；4）沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质。J 核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。J

5、对于某特定细胞器中富集的核酸分子，事先提取该细胞器，然后提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。有坚硬的细胞壁的细胞，首先要破碎细胞。方法有三种：机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用SDS处理细胞；酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。高等动物的DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：1）破碎细胞难，从处死动物分离组织器官到破碎细胞费时长。在长时间内DNA可能会被DNase降解；2）因分子量大，在使用组织匀浆器破碎组织时易造成DNA 断裂；对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。3.DNA

6、提取的几种方法(1)浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。1）用1M 氯化钠提取,得到的DNP粘液;2)与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化;3)离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中;4)用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.（2）阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。（3）苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时

7、,由于蛋白与DNA 连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。1.实验材料，仪器和试剂：（1）实验材料：新鲜猪脾：（2）仪器：量筒：10ml、100ml 3个；烧杯：100ml 2个、250ml 2个；磨口锥形瓶：250ml 1个、500ml 1个；移液管：1ml 1支、10ml 1支；滴管、玻棒、离心机、电动搅拌器、台秤、剪刀、镊子。（3）试剂：20柠檬酸钠2H2加水至1000ml；1SSC，0.1SS

8、C由作相应的稀释得来；NaCL-Na2EDTAgNaCL，3.72g Na2EDTA溶于800ml蒸馏水中，用固体NaOH调PH=8后定容至1000；5%SDS（W/V）：6gSDS溶于100ml45%乙醇中；氯仿-异戊醇=24：1（体积比）其他:95%乙醇，盐，冰.2.2.操作步骤操作步骤:J 取鲜猪脾,去脂、血,称取5g,用预冷的1SSC溶液洗2次，剪碎；J 按脾：1SSC=1;5W/V 加入25ml预冷的1SSC，用高速组织捣碎机破碎8次,每次5秒,中间间隔30秒；J 将匀浆液放在烧杯中，于冰盐浴中冷却10分钟。4，8000rpm离心5分钟。去掉上清，取；J沉淀物中再加2倍体积的1SSC

9、搅匀，离心，弃上清，取，重复2次。J 将所得沉淀悬于5倍体积的PH8.0、0.15M NaCL2EDTA溶液中。边搅拌边慢慢滴加5%SDS最终浓度达1%为止。然后加入固体氯化钠使其最终浓度达1mol/L，继续搅拌，以确保氯化钠全溶。J所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中，加入同体积氯仿异戊醇，激烈振荡10分钟，8000r离心10分钟，上层水相取出后倒入烧杯，以同 积氯仿异戊醇重复去蛋白2次。J 取出水相于烧杯中，逐渐加入2倍体积95%乙醇，玻棒搅动，DNA纤维绕于璃玻棒上后挤干，用70%乙醇洗DNA纤维2次，用95%乙醇洗一次，再用乙醚洗一次，取出并挤干。1、鲜猪脾鲜猪脾 去脂、血去脂、血 5 5g

10、 g 预冷的预冷的1 1SSCSSC洗洗2 2次次 剪碎剪碎,1,1SSC=1:5(W/VSSC=1:5(W/V）捣碎捣碎(8(85s5s，间隔，间隔3030s)s)匀浆液匀浆液 冰盐浴冰盐浴 冷却冷却1010min min 4,8000rpm,5min 4,8000rpm,5min 沉淀物沉淀物 2 2V V 1 1SSC,SSC,搅匀搅匀 4,8000rpm,5min4,8000rpm,5min 弃上清弃上清(重复重复2 2次次)沉淀沉淀 操作步骤3 3、水相、水相 搅拌搅拌 95%95%乙醇乙醇 至溶液澄清至溶液澄清 DNADNA纤维纤维 挤干挤干 70%70%乙醇乙醇 洗洗DNADNA

11、纤维纤维2 2次次 95%95%乙醇乙醇,乙醚乙醚 取出并挤干取出并挤干DNADNA纤维纤维 2 2、沉淀、沉淀 5 5V NaV Na2 2EDTA EDTA 搅拌搅拌,滴加滴加 5%5%SDS(SDS(终浓度达终浓度达1%1%)固体固体NaCL 1M NaCL 1M 搅拌搅拌 NaCLNaCL全溶全溶 混合液混合液 锥形瓶锥形瓶 同体积氯仿同体积氯仿-异戊醇异戊醇 激烈振荡激烈振荡1010min min 4,8000rpm,10min4,8000rpm,10min 上层水相上层水相 同体积氯仿同体积氯仿-异戊醇异戊醇 重复去重复去Pr,2Pr,2次次 水相水相 强酸、加热条件下，可以使DN

12、A中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2脱氧核糖在酸性环境中成为羟基酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400g范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。g二苯胺（需在70%乙醇试剂中重结晶2次)，溶于180ml冰乙酸中，再加入8mlml 1.6%乙醛溶液，所配试剂应为无色。每组需56ml 共需2800ml 、DNA标准溶液：（须经定磷法确

13、定其浓度）取标准DNAN NAOH配成200微克/毫升的标准液。每组需12ml 共需600ml 、1.6%ml，加重蒸水定容至100ml（放于冰箱中，一周之内可以使用）。共需70ml 、待测样品液：准确称取猪脾DNA 5mg,用mol/L的氢氧化钠溶液配成100微克/毫升的溶液。每组需4ml 共需200ml操作方法：操作方法：1.DNAmlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2ml。另取2只试管，各加2ml蒸馏水作为对照。然后各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于60度恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2.制品

14、的测定：取2支试管，各加2ml待测液（内含DNA应在标准曲线的范围之内）和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。3.根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量，计算出制品中的百分含量。数据:DNA纯度：待测液中测得的核酸微克数 DNA%=X 100 待测液中制品的微克数 DNA产率:测得的DNA的微克数 DNA%=X 100 原料的微克数1.为什么在低温下进行？2.加柠檬酸钠和EDTA的作用?SDS的作用？NaCL的作用，为什么要加到1mol/L?5.加入异戊醇有什么作用？生物学基础实验教程.滕利荣主编.长春:吉林科学技术出版社,1999.8,573578.

15、现代分子生物学实验手册.张维铭主编.北京:科学出版社,2003.6,80106.精编分子生物学实验指南.颜子颖、王海林译.北京:科学出版社,1998.6,3040.生物化学与分子生物学实验技术.厉朝龙主编.杭州:浙江大学出版社,2000.6,107116分子克隆实验指南(第三版).黄培堂等译.北京:科学出版社,2002.8,2652.生物化学与分子生物学实验教程.梁宋平主编.北京:高等教育出版社,2003.3,1619.生物化学实验(第三版).陈钧辉,陶力等编.北京:科学出版社,2003.4,128130.生物化学实验指导.余冰宾 主编.北京:清华大学出版社,2004.1,158160.生物化

16、学实验方法和技术.陈毓荃 主编.北京:科学出版社,2002.8,127132技术1：基因组总DNA的大量提取 本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。仪器：高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外分光光度计。试剂：细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl）；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3M NaAC（）；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液 操作：动植物材料10g(鲜

17、组织)0.5g(干冻组织)液氮，研碎10ml裂解液(含1/10体积酚),(65预热)(加入等体积氯仿)(65，30min间隔510min轻摇一次)离心(12000-15000rpm,15min)上清液体积冷异丙醇)体积3MpH5,2乙酸钠）2mlTE(或水)10ulRNase，65,10-30分复溶和除RNA挑取絮状体（70%冷乙醇洗涤,真空干燥）（5000RPM，5min）等体积酚/氯仿,氯仿抽提（轻轻混匀、冰浴沉淀5min）2倍无水乙醇、1/10体积醋酸钠上清液(10000RPM,10min)(-80，30min)(70冷乙醇洗)沉淀基因组DNA干粉(真空干燥)保存：保存：干粉-20保存，

18、或复溶于或水中,分装成小体积,-20或4保存注意注意:l裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解；l2.各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解；l3.取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰；l4.异丙醇,乙醇，醋酸钠，醋酸钾等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀；1.5.本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快速、省时、省钱的特点。技术2：细菌基因组DNA的微量提取法 本方法包括SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分等内容。仪器：同技术1；试剂：TE、TAE缓冲液；10%SDS；NaCL；20mg

19、/ml蛋白酶；CTAB/NaCL溶液(10%CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)；氯仿/异戊醇(24：1)；异丙醇；70及100%乙醇 操作：1.5ml对数生长期细菌100lNaCL(5M)，混匀30l10%SDS,3L蛋白酶，混匀沉淀，溶于500lTE缓冲液中，混匀(37,1小时)(5000rpm,1min离心)80l的CTAB/NaCL,混匀；6510min（可不做）加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液取上清，以下操作与技术1中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA、复溶等步骤一致(混匀)(离心12

20、000rpm,4-5min)上清技术3：酵母菌基因组DNA的提取仪器：同技术1；试剂：SE缓冲液（1M山梨醇，0.1M EDTA pH7.5）；溶菌酶（50mg/ml）；20PVP；蛋白酶K缓冲液（10mM Tris pH7.6 0.5%SDS 1mM EDTA）；其余同前操作：1.5ml对数生长期细菌溶于590ulSE缓冲液中混匀(12000rpm,8-10min离心)(12000rpm,1-2min离心)加入的CTAB/NaCL,200l20%PVP混匀(加入10ul溶菌酶37,1小时)溶于100ulNaCL中混匀(加入蛋白酶，37,1小时)等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀(6530mi

21、n)(12000rpm,4-5min离心)上清,以下操作与技术1中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA、复溶等步骤一致。为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。对于核酸的纯化应达到以下三点要求：1核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；2其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；3排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。l尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；l减少化学因素对核酸的降

22、解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4-10的条件下进行；l减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。l 机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式破裂以及DNA样本的反复冻贮。这些操作细节在实验操作中应倍加注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。对分子量小的环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子，威胁相对小些。l 高温如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中，一般在低温操作，但现在

23、发现在室温快速提取与低温提取，获得核酸的质量没有太大差异。4.防止核酸的生物降解，细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，使用EDTA、柠檬酸盐螯合金属二价离子，基本可以抑制DNA酶活性。而RNA酶不但分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以是生物降解RNA提取过程的主要危害因素。名名 称称 治治 疗疗 范范 围围 核核糖糖核核酸酸(R RN NA A)脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸(D DN NA A)免免疫疫核核糖糖核核酸酸(i iR RN NA A)转转移移因因子子(T TF F)聚

24、聚肌肌胞胞苷苷酸酸(聚聚肌肌胞胞)(p po ol ly y I I：C C)口口服服用用于于精精神神迟迟缓缓、记记忆忆衰衰退退、动动脉脉硬硬化化性性痴痴呆呆治治疗疗；静静脉脉注注射射用用于于刺刺激激造造血血和和促促进进白白细细胞胞生生成成，治治疗疗慢慢性性肝肝炎炎、肝肝硬硬化化、初初期期癌癌症症 有有抗抗放放射射性性作作用用，能能改改善善机机体体虚虚弱弱疲疲劳劳；与与细细胞胞毒毒药药物物合合用用，能能提提高高细细胞胞毒毒药药物物对对癌癌细细胞胞的的选选择择性性作作用用；与与红红霉霉素素合合用用，能能降降低低其其毒毒性性，提提高高抗抗癌癌疗疗效效 推推动动正正常常的的R RN NA A分分子子

25、在在基基因因水水平平上上通通过过对对癌癌细细胞胞D DN NA A分分子子进进行行诱诱导导，或或通通过过反反转转录录酶酶系系统统促促使使癌癌细细胞胞发发生生逆逆分分化化，如如可可用用于于肝肝炎炎治治疗疗的的抗抗乙乙肝肝i iR RN NA A、治治疗疗肺肺癌癌的的抗抗肺肺癌癌i iR RN NA A 相相对对分分子子质质量量较较小小，含含有有多多核核苷苷酸酸、多多肽肽化化合合物物，M M，1 10 00 00 00 0；它它只只传传递递细细胞胞免免疫疫信信息息，无无体体液液免免疫疫作作用用，不不致致促促进进肿肿瘤瘤生生长长，治治疗疗恶恶性性肿肿瘤瘤比比较较安安全全；亦亦可可用用于于治治疗疗肝肝

26、炎炎等等 干干扰扰素素诱诱导导物物，具具有有广广谱谱抗抗病病毒毒作作用用；用用化化学学合合成成、酶酶促促合合成成结结合合方方法法生生产产 名名 称称 治治 疗疗 范范 围围 腺腺苷苷三三磷磷酸酸(A AT TP P)核核酸酸一一氨氨基基酸酸混混合合物物 辅辅酶酶A A(C Co oA A)脱脱氧氧核核苷苷酸酸钠钠 腺腺苷苷一一磷磷酸酸(A AM MP P)鸟鸟苷苷三三磷磷酸酸(G GT TP P)辅辅酶酶I I(N NA AD D)辅辅酶酶(N NA AD DP P)用用于于心心力力衰衰竭竭、心心肌肌炎炎、心心肌肌梗梗死死、脑脑动动脉脉和和冠冠状状动动脉脉硬硬化化、急急性性脊脊髓髓灰灰质质炎炎、肌肌肉肉萎萎缩缩、慢慢性性肝肝炎炎等等 用用于于气气管管炎炎、神神经经衰衰弱弱等等 用用于于动动脉脉硬硬化化、白白细细胞胞、血血小小板板减减少少，肝肝、肾肾病病等等 用用于于放放疗疗、化化疗疗引引起起急急性性白白细细胞胞减减少少症症 有有周周围围血血管管扩扩张张作作用用、降降压压作作用用；用用于于静静脉脉曲曲张张性性溃溃疡疡等等 用用于于慢慢性性肝肝炎炎、进进行行性性肌肌肉肉萎萎缩缩等等症症 用用于于白白细细胞胞减减少少及及冠冠状状动动脉脉硬硬化化 促促进进体体内内物物质质的的生生物物氧氧化化 11