ISH protocol 荧光原位杂交技术 实验方案

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1、地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH,冰冻切片操作过程：1、 多甲固定：应尽量在半个小时内完成。（固定时间以 24-36小时为宜，避免 RNA 降解或固定过度。）2、切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。（选用16um）（切好的片 子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在 4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。（重新固定 10-15min）3、用 0.1MPB 洗切片 3*5min4、切片放入100%乙醇5min,空气中干燥。杂交液：（ 20ml）藏于-20 度20*SSC 4ml硫酸葡聚糖 4g去离子甲酰胺 10ml

2、 将他们溶解后，加入以下物质：Poly A（ 10mg/ml）0.5 mlSsDNA（ 10mg/ml）0.5 mltRNA （ 10mg/ml）0.5 mlDTT （1M）2ml50*Denhardts 0.2ml 上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到 37度。杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是 100ng-1000ng/ml， 一般是以 200ng/ml 为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定， 对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可能30-40ul足够。加好杂交液以后，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何的气

3、泡），为防止杂交 液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的话杂交 会有一个很高的背景）在湿盒中 37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交的信号，但 是前提是不能让切片干燥。杂交后处理 ;制备0.5*SSC和1*SSC （从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用的时候的温度是 55 度。注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10mM的DTT （将1.2g的DTT加入到800ml的 SSC 中）杂交后，用小镊子将盖玻片轻轻移走，然后倒掉杂交液，将切片放入洗液中，在振摇 水浴 中按照下面的要求来洗片：快洗： 1*SSC（10mMDTT）室温2*15

4、min： 1*SSC（10mMDTT） 55度2*15min 0.5*SSC（10mMDTT） 55度1*10min 0.5*SSC（ 10mMDTT）室温 将切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。检测：将切片转移到TBS缓冲液中（100mM tris-HCl, 150mM NaCl, PH=7.5），将切片在 TBS缓冲液中洗3*5min,封闭：（可选）将切片放在封闭液中放置30min （封闭液配方:TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血清 （sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche）,将切片拿出封闭液中，用地高辛抗体和切片在TBS+0.1%triton

5、 X-100+1%正常绵羊血 清（sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche）于室温下孵育至少4小时，然 后在TBS中洗3*5min，然后在去离子水洗涤几次以去除盐，最后用抗淬灭剂分片观 察原位杂交要做的对照;1、切片中mRNA的质量（前提是新鲜的组织样品）和protocol的有效性。 PolyT探针：如果PolyT探针杂交的信号很弱的话，说明切片的RNA已 经降解比较严重。2、杂交特异性对照：检测探针只是和RNA结合，用RNA酶处理后如果没有 杂交信号的，则说明杂交只是和RNA结合。（注意，RNA酶的处理应该在固定以后 用PBS洗两次*5min立即进行） 用正义和反义探针来杂交，如

6、果用正义探针杂交得不到任何的信号，则 可以说明杂交的信号是特异性的杂交预处理：1、在37C恒温箱内干燥切片后，滴加5-10 口 g/ml蛋白酶K,置37C湿盒内孵育 30min，4C75%酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性。一般应用蛋白酶K 1卩g/ml（于0.1 mol/L Tris,50 mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中），37C孵育1520 min，以达到充分 的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂 交信号。甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂，常用0.1 mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用， 应用胃

7、蛋白酶（Pepsin）20100 ug/m l（用 0.1 N HCl配）37C、30 min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。为保 持组织结构，通常用 4%多聚甲醛再固定。2、0.25% 醋酸酐 10min,经 70C 2XSSC 漂洗、40C 2XSSC 各漂洗 15min，2XSSC 3min,切片经75-100%酒精梯度脱水。1. 蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽的靶核酸，以增加探针的可结合性。蛋白酶K浓度过低，不能使靶 核酸有效暴露，浓度过高则组织消化过度，也会影响检测结果。蛋白酶 K 须用蛋白酶 K 缓冲液配制 （O.lmol/L Tris-HCl PH &0, 50mmol/L ED

8、TA,经高压灭菌后备用），蛋白酶K应新鲜配制，低温冰箱 内分装保存。蛋白酶 K 消化组织切片是原位杂交实验流程中重要环节，蛋白酶 K 浓度应力求准确无 误。2. 根据组织类型、固定液的种类，固定时间和切片的厚薄的不同，蛋白酶K浓度也存在 差异，选用蛋白酶K最佳消化浓度是原位杂交成功的必要条件，不可省略 预杂交 预杂交液;去與子甲旺議500）终浓谨5050xSSC（4 SSPE）100屈* 或旬X “醐h印山上疲2$0mi5 x10% SDS50 inf0.5%变性錐鞘叫3 0%1 000 ini临用前加；预杂交液不加配制：先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50C促溶，依次加入

9、其它成份。硫酸葡聚糖在室温 常需数小时才能完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。根据使用方便可分装(最好用铝箔将瓶子包好)存于 4C，可达数月。注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染1、将DEPC处理的切片经ddH20漂洗2X 5min2、按组织片大小，每张切片滴加40 口 1杂交液，置37C温盒内2小时杂交1、抖去甩干杂交溶液，用DAKO魔笔沿组织周围划圈，滴加30 口 1探针杂交液/每张切片(内含20ng地高辛标记的探针)，在某温度下(改温度为：TM-)湿盒内孵育过夜杂交液内加入变性剪切的鮭鱼精子DNA在杂交前加入，与其它杂交液分开储存。杂交液能在一20 C保存几个月杂父后处理1、将切片置3

10、7C 2XSSC中漂洗2X10min。2. 在 37C 2XSSC 漂洗 2X15min、1XSSC 漂洗 2X15min、0.25XSSC 漂洗 2X15min,均需用振荡 漂洗切片。最适复性温度(Opti munm rena turation t empera tu re, TOR)： Tor =Tm - 25C 苛刻复性温度：Ts = Tm - (10或15C) 非苛刻复性温度：Tns =Tm 一 (30或35C) 在2XSSC反应液中，可以根据下列公式计算最适复性温度：TOr =0.51 (G+C%)+47C 减低背景染色背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后(Posthybridiz

11、ation)的酶处理和杂交后的洗涤 均有助于减低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐(acetic anhydride)和三乙醇胺(t riethanolamine)中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了 背景染色。4 杂交后漂洗(1) 2XSSC液内振动移除盖片。(2) 2XSSC 55C 10 minX2。(3) 0 5XSSC 50C 5 minX2。

12、(4) 缓冲液11(含05%封阻试剂，用缓冲液I溶解)37C 30 min。(5) 缓冲液 I (100 mmol/L Tris HCl,15 0 mmol/L NaCl pH7 5)15 min,室温。(6) 酶标地高辛抗体(1： 5 000，应用缓冲液I解释)37C 30 min。(7) 缓冲液I 15 minX2,室温。(8) 缓冲液 111(100 mmol/L Tris HCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl 2,pH95)室温，2 min。(2)杂交后漂洗其目的是去除未参与杂交体形成的过剩探针,消除与组织或细胞之间的非特异性结合的探针， 降低背景染色，

13、增加信/噪比。将杂交玻片从湿盒(或杂交仪)中取出，用2XSSC将盖玻片洗脱,2XSSC 30C洗2次，每次15 min;1X SSC 42C洗2次，每次15 min;0 5XSSC 37C洗2次，每次15 min,TBS缓冲液洗2次。注意在漂洗 过程中切不要使切片干燥。(5)对照试验 阳性对照:用已知含靶核酸序列的组织作对照。 阴性对照:用已知不含待测靶核酸序列的组织作对照。 用免疫组化检测方法来确定杂交信号的分布。 省略标记探针。 DNA酶消化靶DNA对照。HJ1(6)非特异性染色非特异性染色可能会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等;探针特异性不高 以及组织细胞内某些成分与显示系统

14、中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色。组 织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因，目前最常用的酶是过氧化物酶和 碱性磷酸酶，这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应 步骤。如过氧化物酶用3% H202处理510 min;10%冰醋酸处理组切片10 min,或在底物显色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。NBT/BCIP显示 碱性磷酸酶时如果在光照下显色也会增强非特异性染色。必须根据检测系统不同 的标记酶作不同的内源酶处理。2.探针的长度原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为 背景着色

15、度高低与探针浓度有关。最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合 度为目的。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记cRNA探针的浓度为0.5ng/ul,而非 放射性标记cRNA探针的浓度1.0ng/ul。杂交液的量要适当，每张切片以30-50卩l为宜。保持杂交 液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。3杂交的温度和时间设置和调整杂交温度是RNA原位杂交的重要环节。杂交温度应低于解链或融解温度(melting temperature Tm)20-30C。多数RNA原位杂交Tm为95C，由于这一温度对保存组织形态完整和组织 切片的粘附将产生不利影响，为此在杂交液中

16、常以增加甲酰胺浓度来降低Tm值，因为每增加1%甲 酰胺浓度可降低0.72C。另外杂交体中GC的百分比，杂交体长度以及杂交液中Na+的浓度也与Tm呈 正相关。杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过 长会增加非特异性着色。一般RNA原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以避 免光线对甲酰胺的电离作用。为利于mRNA检测，固定时间不要超过36小时，以免引起RNA与蛋白质之间发生交联。(三)预杂交(1)切片用 DEPC 处理的 PBS PH7.4(140mmol/L NaCl，2.7mmol KCl,10mmol/L Na2HP04, 1.8m mol

17、/L KH2P04)孵育 2X5min，再用 DEPC 处理的含 100mmol/L 苷氨酸(Glycine)PBS 孵育切片 2X5min。(2)用 DEPC 处理的含 0.3% Tri ton X-100 PBS 孵育 15min。(3)用 DEPC 处理的 PBS 漂洗 2X 5min。(4)冰冻切片用 TE 缓冲液(100mmol/L Tris-HCl ,50 mmol/L EDTA PH &0)不含 RNA 酶的 lu g/ml蛋白酶K,在37C下通透切片30 min。石蜡切片用TE缓冲液配制的不含RNA酶的5-20 u g/ml 蛋白酶K,在37C下通透切片30min。(5)在4C

18、下用DEPC处理的4%多聚甲醛PBS溶液作后固定 5min。(6)再用DEPC处理的PBS冲洗切片2X5min。(7)切片作酸酐处理，处理液含0.25醋酸酐、 0.1mol/L三乙醇胺(Triethanolamine TEA)PH8.0,振荡漂洗2X5min。(8)在37C 孵育切片后，杂交 缓冲液冲洗(含50%去离子甲酰胺的4XSSC),至少10 min。注意事项(1) 切片的通透化是RNA原位杂交关键步骤，特别对回顾性资料尤为重要，因固定液种类和固 定时间的不同，需作最佳通透化条件探索，包括蛋白酶K浓度，孵育时间20-30min之间调整 ，甚至采用0.2mol/L HCL配制的0.1%胃蛋

19、白酶。(2) 由于醋酸酐极不稳定，宜将醋酸酐在使用前加到TEA缓冲液中。(3) 1 XSSC = 150mmol/L NaCl,15mmol/L sodium citrate pH7.2。(四)免疫荧光检测1. 滴加封闭缓冲液(100mmol/L Tris-HCl PH7.5、150mmol/L NaCl、2% BSA)置 37C 湿盒内30min，以封闭非特异性结合部位。2. 沥干细胞片，滴加抗地高辛抗体(1:200、1:500用封闭缓冲液配制)在37C内45 min。3. 用 Buffer A PH7.5(100mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、0.05% Tw

20、een 20)冲洗漂洗 各 5min。4. 由低浓度至高浓度(70%, 90%，100%)各级酒精梯度脱水各5min。5. 空气中干燥细胞片。6. 滴加甘油显色混合液。注意事项甘油显色混合液的配制：9份甘油比1份(1mol/L Tris-HCl(PH7.5), 2% 1.4-diaza-bicyclo -2.2.2-octane (DABCO)和 DNA 复染剂(或碘化丙啶 Propidium iodide PI 500ng/ml)或 DAP I (75ng/ml)7. 在荧光显微镜下观察。3预杂父和杂父(1) 加约30 ul预杂交液在每张载片上，室温孵育1 h。如加鲱鱼精子DNA，用前须在沸

21、水浴中 加热变性10 min,酵母tRNA不用加热。(2) 预杂交后以2XSSC漂洗，以吸水纸试干切片周围水份，应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo 探针,浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前 促黑激素(proopiomelanocortin,P0MC)mRNA 的 Oligo 探针，其理想工作浓度为 342 ng/ml(0342 ng/ul)。加30 ul杂交液在切片上,加硅化盖玻片，在37C过夜。如探针大于36碱基则杂交温度为42C。次日室温2XSSC液漂洗切片1 ho(5)1XSSC漂洗切片1 h (室温)。0 5XSSC 37C漂洗半小时。(7) 05XSSC

22、室温漂洗半小时。(8) 显示等方法同前述。Application DilutionCone. Sufficien1:5001:10000:2-0:4in situ hybridizati on2. Denhardt液通常配成10x, 50x或100x的储备液Wx50 xEOOx骤蔗摘（Fi叔1 400）21020耳聚乙烯毗错烷酮fpvR210哋弟血渭號蛋白（的Q21020f.灭茵或 DEPC 水）-1000 in配制：称取上述试剂，溶于800ml左右灭菌ddHQ中，定容至1000ml后，过滤后于-20C保存备用。该液用于配制杂交液及予杂交液等。1蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K）

23、蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分 子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种 类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其 配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20C存放，用时再取出冻融，余者弃去。（2）工作液（临用前配）：方准一100fd4ml取储备液（1mg/ml）按1: 40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。_ f P

24、ro, K S8 备液（ling/ml） 方法二：*I Pro.K缓冲疱lOOpl（3）关于P-K缓冲液的配制:O.lmol/L 畑-HCID .OSiiwIZL EDlAr hnol/l. Tri- HCi(pllS,0) 配制：Omot/L IOTAddlLOKimIO ml帥山称取上述试剂，充分混合即可。1mol/L 的 Tris-HCI(pH8.0)：TrisNdlKO12Mg_ I 000ml先将Tris于800ml ddH2O中溶解，用HCI将pH调至8.0,ddH2O定溶于1000ml,高压灭菌，室温备用即可。0.5mol/L 的 EDTA：EDTA186,lghldJLO I

25、000ml称取EDTA溶于约600ml ddH2O中，常需60C持续搅拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0时，EDTA才开始溶 解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH调pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml，高压灭菌，室温备用。2甘氨酸（1） 1mol/L 甘氨酸：甘氨酸.ddH2O（或 DEPC 水）75g“ I OOOml称取甘氨酸75g溶于ddH2O或DEPC水中，最后补足ddH2O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，- 20C储存。（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：Jrrwl/L甘氨酸LPBS100ml900ml将二者按1： 10比例稀释，即得甘氨酸工作液。一般

26、要求临用前新鲜配制。甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用，以防过度消化。3. 0.25%醋酸-0.25%醋酸酐试別r W HUA璋酸阳(临用幽诫1 3 .2irll5.g4, Ornl足容至丨OOOml约9S0nil)2.5ml配制：按上述配方，先以少许DEPC水溶解NaCI，然后加入三乙醇胺及浓HCI。DEPC水定容至约 1000ml(997.5ml),临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐，充分混合。注意操作时避免浓HCI溅出，最好在通风条件 下进行。生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片 标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非

27、特异吸附，降低反应背景的作用。4. RNA酶溶液J RNA 酶 AICOnd100/J100ml1 DEPC 水取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分装成小份(1ml,10mg/ml)，-20C储存。M RNA SS A 储备液 lOmg/rnl) 工作液:(2 xSSC临用前，取RNA酶A储备液，用2xSSC溶解配成工作液(0.01mg/ml).5.0.2%Triton X - 1002 mlI PBS99蛊ml取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振荡使其充分混合。八、杂交后漂洗溶液无论用何种标记方法及何种信号显示方法，在杂交后洗脱则是大同小异。在此，归纳

28、几种带有共同性及常用的洗 脱液。|2x5SC1 .IOObiJ10n)-1 lOOOmK定容戈端 Tinon X - 1(X)(或 0血 S&Sj SSL试剂： WiTiiw X- 100( 30%- ST)S)I畑為I该液常用于杂交后的初次洗脱，故离子强度(张力)较高。1 JO J x SSCb + l站Triinn X 印0（滅前霽5DS |20x SSC就如* 触 TriLois X -】加（或FO% SDS） 天摘 iklllJJ5 milOinl一 i oo如h（定容）该液常用于杂交后的第二次洗脱，离子强度较低，经过上述两套洗脱液洗后，有的还可用2xSSC, 10% (0.1%) S

29、DS洗脱。f UNA 隘匕 X SSC1000-IQOmi主要是洗去残留的RNA,降低背景。用于以RNA为探针的原位杂交方法中。4. Dig标记探针杂交后处理液3ino/L缓冲菠 k SmoI/LNaGl B5A100ml0 -1 jnol/L20ml 0.1l/L2mwvil/t3匪孑 ,(常费.不能fn,叮省略)用ddH2O溶液并定容至1000ml。缓冲液2：fTSMj-1 mol/L Tris（pH7.5）5rnuJ/L aCI.I mol/L MCl2JOOnJ0 r 1 nioI/L20 ml0 . mol/I，50nJ50miuol/L用ddH2O溶解并定容至1000ml。鑲沖液 3 ； fl mol./L- rtt；（ jjH7.5 ） T*（终止液）i mol/L LDTA2（）1111 20rimcl/J5 ml 5mmol/L配制同上。