(整理)基因工程的定义

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1、1. 基因工程的定义 ：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪 切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬 菌体 DNA） ，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表 达出基因产物。2. 碱抽提法提取质粒 DNA 原理和步骤3、DNA 的定量和纯度测定1. 紫外光谱法2. 琼脂糖凝胶电泳估计原理：3. DNA 的凝胶电泳的原理相同分子量的 DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。4. 限制性核酸内切酶 是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列（4 8bp）,并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。功能即在核酸分子链的内部制造切口的酶。自

2、我保护作用。 用来保护宿主不受外来 DNA 的感染，可降解外来 的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。各自的特点I型限制性内切酶II类限制性内切酶III类限制性内切酶IIIIII酶分子内切酶与甲基化 酶分子不在一起三亚基双功能 酶二亚基双 功能酶识别位点4-6bp 大多数为回文对称结构二分非对称5-7bp非对称切割位点在识别位点中或 靠近识别位点无特异性 至少在识别位点外1000bp在识别位 点下游24-26bp限制反应与 甲基化反应分开的反应互斥同时竞争限制反应是 否需要ATPNoYesYes粘性末端(sticky ends , cohensive e

3、nds )含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：5端凸(如EcoR I切点);端凸(如Pst I切点) 限制性内切酶识别的序列1. 长度：一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。? 4个碱基：sau3A I? 5个碱基:EcoR II? 6个碱基:EcoR I? 7个碱基:BbvC I? 8个碱基:Not I限制酶识别序列的结构大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。有些识别非对称序列，有些可以识别 多种序列，ACC I识别序列是GT = MKAC,可以识别4 中序列；有些识别的序列呈 间断对称，对称序列之间含有若干任意碱基位点偏爱(site preferences)某些限制

4、酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。酶切反应条件缓冲液，反应温度，反应时间，反应中止星星活性(star activity)在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。引起星星活性的因素 高浓度甘油(5%) 酶过量(100U/g) 低离子强度(pH8.0) 有机溶剂PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(dimethylacetamide )、二甲基 甲酰胺 (dimethylformamide )、 sulphala ne 用其它二价阳离子代替Mg+Mn+， Cu+， Co+, Zn+不同

5、的酶对上述条件的敏感性不一样PstI比EcoRI对高pH更敏感，但后者对甘油浓度更敏感同裂酶(Isoschizomers)识别相同序列的限制性内切酶，但它们的切割位点可能不同。同尾酶(Isocaudamers )识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。女口BamH I、Bgl IIBcl I、Xho I 等影响限制性内切酶活性的因素及使用注意事项1. DNA的纯度2. DNA的甲基化程度3. 温度4. 缓冲液(Buffer)T4DNA连接酶的功能主要是催化双链DNA 一端的3-OH与另一双链DNA 5 端的磷酸根形成3：5磷酸二酯键，使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。DNA聚合酶3

6、5 外切5 3 外切聚 合持续能酶活性酶活性速率力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Kle now fragme nt低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中Taq DNA聚合酶无有快高大肠杆菌DNA聚合酶I 一条单链多肽。 5 3外切酶活性位于N端。5 3NA聚合酶活性3 5外切酶活性在没有dNTP的情况下，外切活性占主导地位，而当存在足够的dNTP 时，外切活性和合成活性将处在动态平衡中，结果使得 dsDNA成为 平末端。Kle now fragme nt具有5 3聚合酶活性和3 5外切酶活性。（失去

7、了 5 3外切酶活 性）（在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解，从全酶中除去5外切活性片 段，而聚合活性和3外切活性不受影响。逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）（来源 RNA肿瘤病毒。AMV的性质二链多肽（62kDa/94kDa）具5 -3NA聚合活性具很强的RNA酶H活性（降解与DNA杂交的RNA）碱性磷酸酶 该酶可从 DNA 分子的 5端去除磷酸基碱性磷酸酶用于从 DNA 片段上除去 5磷酸，以防止自身连接。核酸分子杂交定义用标记的已知 DNA 或 RNA 片段(探针)来检测样品中未知核酸序 列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合， 再经显影或显色 的方法，将结合

8、核酸序列的位置或大小显示出来。待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化 的基因组 DNA 和组织细胞的 RNA 。A260 值达到最大值 1/2 时的温度称为解链温度或 熔解温度( melting temperature,Tm) ，此时 50% 的 DNA 分子发生了变性。 Tm 与核酸的 G、 C 含量有关。Tm= (G+C) % 0.41+69.3Tm 也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。核酸探针1. 定义： 一段带有检测标记的与目的基因或目的 DNA 特异互补的已 知核苷酸序列。为确定探针是否与相应基因组 DNA 杂交，有必要对探针加以标 记，以便在结合部位

9、获得可识别的信号。探针的分类：据制备方法及核酸性质不同，可分为:1 基因组DNA探针2 cDNA探针3 RNA探针4 寡核苷酸探针Southern印迹杂交限制性内切酶酶切后（EDTA , 琼脂糖凝胶灭泳分离酶切DNA片变性液（碱变性）预杂交杂交放射自显影结果分析凝胶上DNA变Tris缓冲液中和1高盐下DNA转印至NC烘干、固定Taq DNA 聚合酶1986 年 H.A. Erilish 从嗜热 水生菌分离出耐高温的 Taq DNA 聚合 酶，代替大肠杆菌 DNA 聚合酶 Klenow 片断（37 oC ） ，PCR 技术才 进入实用阶段PCR 基本原理在模板 DNA 、引物和 4 种脱氧核苷酸

10、存在条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应。1、变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链 DNA 。2、退火：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的 DNA 模板在局部形成杂交链。3、延伸：在 DNA 聚合酶和 4 种脱氧核苷酸（ dATP 、dCTP 、 dGTP、dTTP）及Mg2+存在条件下，53的聚合酶催化以引物为起 始点的 DNA 链延伸反应。PCR 的特点1 ）特异性强2 ）敏感性高（ 3）快速（4）简便(5) 可以扩增mRNAPfu DNA Polymerase有3 -5 的外切酶活性，5-3外切酶活性。是目前已发现的所有耐高温 DNA聚合酶中出错率最

11、低的但PCR产物为平端！引物设计：(1) 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列(2) 弓I物长度以15-40 bp为宜。(3) 碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。(4) 引物内部避免形成二级结构。(5) 两引物间避免有互补序列。(6) 引物3端为关键碱基；5端无严格限制。重组DNA技术基本原理基本原目的基因的获一k克隆载体的选择和构 外源基因与载体的连一k DNA导 入受体一重组体的筛一克隆基因的表达目的基因的获取1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。2. 基因组 DNA 文库 (genomic DNA library)3. cDNA 文库(cD

12、NA library)4. 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) (见第 22 章)在基因工程操作中，把能携带外源 DNA 进入受体细胞的 DNA 分子 叫载体。克隆载体 (cloning vector) 为使插入的外源 DNA 序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体 (expression vector)为使插入的外源 DNA 序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称 为表达载体。载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定;丁有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点, 称为多克隆位点；分子量小，

13、以容纳较大的外源 DNA。外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接2. 平端连接3. 同聚物加尾连接4. 人工接头（linker）连接重组DNA导入受体菌 感受态大肠杆菌的制备用CaCI2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性感受态细菌：是指细菌处于容易接受外源DNA的状态。重组体的筛选感受态细胞：?经一定方法处理（如CaCI2处理）后具备接受外界DNA能 力的大肠杆菌。受体菌应为安全无毒菌株。（容易接受外 源DNA的状态）? 方式：转化、转染、感染转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载体DNA导入受体细胞。转染：重组DNA导入真核细胞的过程。感染：以噬菌体为载体，在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，使

14、其感染受体菌重组体的筛选厂1.遗传检测法抗药性标志的选择晝标志补救（？-半乳糖苷酶法）f 2.电泳检测法書3.PCR检测法f 4.菌落杂交筛选法蓼5.免疫化学检测法蓼6. DNA序列检测E.coli表达体系优势：一种成熟的基因克隆表达的受体细胞繁殖迅速，培养代谢易于控制易于进行遗传操作和高效表达不足之处：1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。4） 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体（in elusion body）5）很难表达大量可溶性蛋白外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1.细胞质中表达（1）包涵体（inclusion body ）是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物2. 周质中表达3. 胞外表达二、克隆载体复制基因 (replicator)选择性记号克隆位点